183122. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai eljárás rosszindulatú neoplazmák kimutatására
1 183 122 2 lámhosszon. Az eluált protein 7,7 %-át tartalmazó III csúcsnak megfelelő eluátum tartalmazza az X inhibitor proteint. Ezt a fentiek szerint kezeljük, majd újra Sephadex G-200 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást a fenti pufferral végezzük. Az oszlopról 3 ml térfogatú frakciókat szedünk frakciókollektorral (Gilson Medical Electronics, Inc., Middleton, Wis.), az elúciót spektrofotométerrel (280 nm) ellenőrizzük. A fehérje koncentrációját Lowry-módszerrel határozzuk meg. 2. példa Az X inhibitor protein tisztítása: B eljárás A gátló protein tisztítását Amicon szűrővel végzett molekulaszűréssel, dialízissel és Sephadex gyantából készült oszlopon való kromatográfiával végezzük. 1—5 ml humán szérumot Amicon Conical szűrőcsövekben (Amicon Lexington, Mass.) centrifugálunk 5000 g nehézségi gyorsulás mellett 10 percen át 4 °C hőmérsékleten. A centrifugálás után a szűrőn fennmaradó anyagot ionmentes vízben szuszpendáljuk, annyi ionmentes vizet használunk, amennyi a kiindulási szérum térfogata volt. A fennmaradó és az átszűrődő minták alikvotjait megvizsgáljuk gátló aktivitás szempontjából. A szűrőn fennmaradó aktív frakciót cellulóz csövekben dializáljuk hússzovos térfogatú ionmentes vízzel szemben 4 °C hőmérsékleten, 24 órán át. Ezután a dializálódó oldatot és a dializátumot fagyasztva szárítjuk, és ionmentes vízben reszuszpendáljuk, A két frakció aktivitásmérés eredménye szerint a dializálódó oldat mutatja a gátló aktivitást. Egy ml ilyen oldatot Sephadex G-50 gyantából készült 60X5 cm méretű oszlopra juttatunk, az eluálást 0,07 mól/l-es 6,8 pH-jú nátrium-foszfát pufferral végezzük 4 °C hőmérsékleten, óránkénti 30 ml-es sebességgel. 5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk (Buchler Fractomette Alpha 200; Searle, Fort Lee, N. J.). Spektrofotométeren 280 nm hullámhosszon meghatározzuk a frakciók elnyelését, majd az elnyelési maximumok alapján összegyűjtjük a frakciókat. Ezeket fagyasztva szárítjuk, dializáljuk, és á fentiek szerint meghatározzuk gátló aktivitásukat. Az „aktív” anyagot tartalmazó frakciókat Sephadex G-75 és G-100 gyantából készült oszlopokra juttatjuk, és a G-50 gyantából készült oszlop használatakor megadottak szerint eluálunk. Meghatározzuk a frakciók gátló aktivitását, majd Sephadex G-200 oszlopra juttatjuk az aktív oldatot. Az oszlopot 0,07 mól/l-es 6,8 pH-jú nátrium-foszfát pufferral eluáljuk szobahőmérsékleten, óránként 6-8 ml-es átfolyási sebességgel. 3 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk Gilson mikrofrakciószedővel (Gilson, Middleton, Wis.). 280 nm hullámhosszon meghatározzuk az egyes frakciók elnyelését, majd az elnyelési maximumok alapján összegyűjtjük a frakciókat. Mindegyik frakciót fagyasztva szárítjuk, dializáljuk, és a fentiek szerint meghatározzuk gátló aktivitásukat. A gátló aktivitás a III frakcióban van jelen. A III frakciót Sephadex G-200 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást a fentiek szerint végezzük. A Sephadex G-200 gyantáról eluálódó III frakció tartalmazza az X gátló fehérjét, amely több mint ezerszeresen tisztult. 3. példa Az X inhibitor protein PM-2 dezoxi-ribonukleinsav fluoreszcencia mérését az alábbiak szerint végezzük. Az X gátló protein IC50-értékének meghatározása. Az ICS0-érték meghatározását az emberi szérumban levő X gátló protein esetén két lépésben végezzük. Az IC50 -érték megadja azt a protein-koncentrációt, amely a PM-2 dezoxi-ribonukleinsav degradációjának 50 %-os gátlásához szükséges. 1. A szérumban levő protein koncentrációját Lowrymódszerrel meghatározzuk. 2. A PM-2 dezoxi-ribonukleinsav bleomicinre kidolgozott fluoreszcencia mérését felhasználjuk a szérumban levő protein (gátló protein) dózis-válasz görbéjének felvételére. Az ICS0-értékeket úgy határozzuk meg, hogy a dezoxi-ribonukleinsav degradációjának százalékos gátlását és a protein koncentrációját ábrázoljuk logaritmikus összefüggésben. Részletesen az alábbiak szerint járunk el; I. Lowry-reakció A) A törzsoldatok készítése: a) oldat: 2 %-os 0,1 n nátrium-hidroxiddal készült nátrium-karbonát oldat; b) oldat vízzel készült 1 %-os réz-szulfát (5 kristályvizes) oldat; c) oldat : vízzel készült 2 %-os nátrium-kálium-tartarát oldat; d) oldat: 2 n Folin-Ciocalteau fenol-reagens. B) A reagensek elkészítése : 1. reagens oldat: 1 térfogat b) törzsoldatot egy térfogat c) törzsoldattal keverünk. 2. reagens oldat: 50 térfogat a) törzsoldatot és 1 térfogat 1. reagens oldatot keverünk. 3. reagens oldat: 1 térfogat d) törzsoldatot és 1 térfogat vizet elegyítünk. C) Reakciók : 1. A szérumot vízzel 1:10 arányban hígítjuk. 2. 10 pl hígított szérumot 13X100 mm térfogatú üvegcsőbe töltünk, és 290 pl vizet adagolunk. 3. 1 ml 2. reagens oldatot adagolunk, alaposan összekeverjük az elegyet, és 10 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. 4. 100 pl 3. reagens oldatot adagolunk, alaposan összekeverjük a reakcióelegyet, és 30 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. 5. Spektrofotométeren 750 nm hullámhosszon meghatározzuk az elnyelést. 6. A bovin szérum-albumin standard görbéből meghatározzuk a protein koncentrációját. D) A bovin szérum-albumin standard görbe felvétele 1. A bovin szérum-albuminból sorozathígításokat készítünk (például 25, 50, 75,100, 150pg/ml), a végtérfogat minden esetben 0,3 ml. 2. A C) fejezetben megadott reakciókat végezzük el a 3. pontban megadottaktól (a 2. reagens oldat adagolása) . 3. Meghatározzuk 750 nm hullámhosszon az abszorpciókat, majd az elnyelés függvényében ábrázoljuk a bovin szérum-albumin koncentrációkat. IL A gátló protein mérése A) A szérum proteinből sorozathígításokat végzünk a Lowry-reakció segítségével meghatározott szérum protein-koncentrációk alapján. A hígításokat nátrium-borát pufferral végezzük, amely 0,05 mól/l-es és pH-ja 9,5. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
