183122. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai eljárás rosszindulatú neoplazmák kimutatására

B) A szérum protein 50 pl térfogatú mintáihoz 10 pl 34,5 nmól/l-es bleomicin oldatot adagolunk, a reakcióelegy 13X100 mm térfogatú üveg vizsgálócsőben van.

C) A fenti elegyhez 2-merkapto-etanolra 5

25 mmól/l-es 390 pl 0,05 mól/l-es és 9,5 pH-jú nátrium-borát puffert adunk.

D) 8,3X 10"5 mól/l-es 0,15 mólos nátrium-kloriddal

készült PM-2 dezoxi-ribonukleinsav oldatból 50 pl-t adagolunk. 10

E) A reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk.

F) Három-három kémcsőbe egyenként 100 pl fenti reakcióelegyet adagolunk, a kémcsőbe előzőleg 0,09 mólos 12,1 pH-jú 0,9 ml olyan trinátrium-foszfát oldatot 15 adtunk, amely 0,01 mól/l-es etilén-diamino-tetraacetátra

és 0,01 mól/l-es nátrium-kloridra. Erőteljesen összekeverjük a reakcióelegyet.

G) 100 pl 55,7X10"6 mólos, 12,1 pH-jú trinátrium-foszfát pufferral készült etidium-bromid oldatot adago- 20 lünk, majd alaposan összekeverjük a reakcióelegyet.

H) Kontrollok

1. 0,05 mólos 9,5 pH-jú 2-merkapto-etanolt igen, bleomicint vagy proteint nem tartalmazó nátrium-borát oldat.

2. Protein oldat bleomicin vagy PM-2 dezoxi-ribonukleinsav nélkül.

3. Protein oldat bleomicin nélkül.

4. 2-Merkapto-etanolt tartalmazó 0,05 mólos,

9,5 pH-jú nátrium-borát oldat (vak minta).

I. Spektrofoto-fluorometrálás (Aminco-Bowman)

A mintát 1 cm vastagságú kvarc küvettába helyezzük, és 530 nm gerjesztésnél és 590-es kisugárzásnál mérjük a 35 fluoreszcenciát.

1

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás rosszindulatú neoplazmák kimutatására humán szérumban, azzal jellemezve, hogy meghatározzuk a vizsgálandó szérum mintában a jelenlevő, DNS-hez kötődő specifikus X inhibitor protein koncentrációját, és az így kapott koncentráció-értéket összehasonlítjuk rákmentes személyek szérumában levő normális X inhibito protein-koncentrációval.

2. Az 1. igénypont szerinti kimutatási eljárás foganatosít ási módja, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó szérum mintában az X inhibitor protein-koncentrációt a PM-2 dezoxi-ribonukleinsav bleomicin-indukált degradációjának 50 %-os gátlásához szükséges mennyiségének (IC5 ») mérésével határozzuk meg, és az így meghatározott IC50-értéket hasonlítjuk össze rákmentes személyek szérumának mérésekor kapott normális ICso -értékkel.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az IC50 -érték meghatározására, azzal jellemezve, hogy

(1) a szérum mintát bleomicin, a PM-2 dezoxi-ribonukleinsav és a 2-merkapto-etanol 9,5 pH-jú pufferral készült oldatával elegyítjük;

(2) az (1) szerinti elegyet 30 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk;

(3) a (2) lépés szerinti elegy alikvot mintáját 12,1 pH-jú denaturációs pufferral készült etidium-bromid oldathoz adjuk;

(4) a (3) lépés szerinti etidium-bromid - PM-2 dezoxi-ibonukleinsav elegy fluoreszcenciáját 530 nm gerjesztésnél és 590 nm kisugárzásnál spektrofoto-fluorométeren meghatározzuk;

(5) a minta és bleomicint nem tartalmazó kontroll mima fluoreszcenciájának változásából meghatározzuk a bleomicin által indukált PM-2 dezoxi-ribonukleinsav degradációjának százalékos gátlását;

(ó) Lowry-módszerrel meghatározzuk az X inhibitor protein koncentrációját; és

(7) az (5) és (6) lépésekben kapott értékekből meghatározzuk azt az X inhibitor protein koncentrációt, amely szükséges a bleomicin által indukált PM-2 dezoxi-ribonukleinsav degradáció 50 %-os gátlására.

2

40

183 122

25

30

Ábra nélkül

5