183115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Candida Guilliermondii-fertőzés kimutatására, megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmas immunbiológiai készítmények előállítására
1 183 115 2 A Cgl jelű immunbiológiai készítményt Candida guilliermondii-fertőzésben szenvedő emberek és állatok gyógykezelésére is felhasználhatjuk. Ebben az esetben először a kezelendő egyedet a készítménnyel deszenzibilizáljuk, majd a Cgl jelű immunbiológiai készítményt intradermális, intramuszkuláris vagy szubkután oltások formájában visszük be a szervezetbe. Az immunbiológiai készítmény ebben az esetben is tartalmazhat hordozóanyagot (például alumíniumhidroxid-gélt), amely a hatóanyag lassú, fokozatos felszívódását biztosítja. Az immunbiológiai gyógykezelés alkalmával az első oltást követően kéthetenként ismételten oltjuk az egyedeket oly módon, hogy minden következő oltásnál fokozatosan nagyobb mennyiségű antigén kerüljön a szervezetbe. A kezeléshez szükséges dózisok mértéke számos tényezőtől, így a kezelendő egyed korától, a fertőzés mértékétől, súlyosságától, az állat fajától, a kezelés módjától és gyakoriságától függően változik. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa Cgl jelű immunbiológiai készítmény előállítása 500 ml-es rázólombikba 250 ml standard folyékony dextróz(pepton)élesztő leves táptalajt (lásd Palmer, D. F. és munkatársai: Serodiagnosis of mycotic diseases,44 pp. Charles C. Thomas, Illinois, USA (1977)) töltünk. A táptalajt a Candida guilliermondii fenntartott tenyészetével oltjuk be, majd 48 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A tenyésztés közben a lombikot 130 fordulat/perc sebességgel rázzuk. Az így kapott tenyészetet oltótenyészetként használjuk fel a következő lépésben. 20 literes laboratóriumi fermentorba 10 liter, az előzővel azonos összetételű táptalajt töltünk, és a táptalajhoz hozzáadjuk a fentiek szerint előállított oltótenyészetet. A tenyésztést levegőztetés és keverés közben 37°C-on végezzük. A szaporodás 72 óra elteltével fokozatosan csökken, majd leáll. A tenyésztést ugyanilyen körülmények között még 15 napig folytatjuk (fenntartó vagy prolongált tenyésztés). Ezután a tenyészetből Gram-festéshez mintát veszünk. Amennyiben a minta festődik, ez baktériumszennyezések jelenlétére utal; ekkor a tenyészetet nem használhatjuk fel immunbiológiai készítmény előállításához. Ha az elvégzett vizsgálat szerint a tenyészet nem tartalmaz baktériumszennyezést, a fermentor tartalmát centrifugába töltjük, és a gomba sejtanyagot centrifugálással (10 perc, 1000 fordulat/perc) elkülönítjük a folyadékfázistól. A kapott sejtanyagot élettani konyhasó oldattal háromszor mossuk, centrifugáljuk (10 perc, 1000 fordulat/perc), majd élettani konyhasó oldatban szuszpendáljuk, és a szuszpenziót X-press típusú készülékben kb. 10 000 kg/cm2 nyomáson feltárjuk. A szilárd anyagot centrifugálással (3000 fordulat/perc, 30 perc) eltávolítjuk, a felülúszót Seitz-szűrőbetéten szűrjük, majd a szűrlethez 4 térfogat 96 %-os etanolt adunk. A kivált csapadékot leszűrjük, majd élettani konyhasó oldatban oldjuk, és az oldatot —20 C-on fagyasztva szárítjuk. A fermentációtól, feltárástól függően a kapott kb. 500 mg liofilizált por alakú terméket porampulla kiszerelésben hozzuk forgalomba és felhasználhatjuk mint allergent a korai túlérzékenységi reakción alapuló intradermális próbához. 2. példa Cg2 jelű immunbiológiai készítmény előállítása 500 ml-es rázólombikban 250 ml standard folyékony dextróz/pepton/élesztő leves táptalajt töltünk. A táptalajt a Candida guilliermondii fenntartott tenyészetével oltjuk be, majd 48 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A tenyésztés közben a lombikot 130 fordulat/perc sebességgel rázzuk. Az így kapott tenyészetet oltótenyészetként használjuk fel a következő lépésben. 20 literes laboratóriumi fermentorban 10 liter folyékony dextróz/pepton/élesztő leves táptalajt töltünk és a táptalajhoz hozzáadjuk a fentiek szerint előállított oltótenyészetet. A tenyésztést levegőztetés és keverés közben 37 “C-on 72 órán át végezzük. Ezután a tenyészethez annyi 30-40 %-os vizes formaldehid-oldatot adunk, hogy a tenyészet végső formaldehid-koncentrációja 0,5 % legyen. Majd a tenyészetet keverés közben még 6 órán keresztül tovább inkubáljuk 37 °C—on. Ezután a tenyészetből mintát veszünk, és a gomba életképességét Sabouraud dextróz agarra történő leoltással ellenőrizzük (a lemezeket 37 °C-on 48 órán át inkubáljuk). A tenyészetből Gram-festéshez mintát veszünk. Amenynyiben a minta festődik, ez baktériumszennyezések jelenlétére utal; ekkor a tenyészetet nem használhatjuk fel immunbiológiai készítmény előállításéhoz. Ha az elvégzett vizsgálat szerint a tenyészet nem tartalmaz baktériumszennyezést, a fermentor tartalmát centrifugába töltjük és 10 percig 1000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A szilárd anyagot elkülönítjük 0,85 %-os vizes nátriumklorid-oldattal háromszor mossuk, centrifugáljuk (10 percig 1000 fordulat/perc sebességgel). A szilárd anyaghoz 0,85 %-os vizes nátriumklorid oldatot adunk, és a kapott sejtszuszpenziót X-press típusú készülékben kb. 10 000 kg/cm2 nyomáson feltárjuk. A kapott sejthomogenizátumot 30 percig 5000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, a felülúszót elkülönítjük, Seitz-szűrőbetéten szűrjük, majd a szűrlethez 4 térfogat 96 %-os etanolt adunk. A kivált csapadékot leszűrjük, majd élettani konyhasó oldatban oldjuk és az oldatot —20 °C-on fagyasztva szárítjuk. A fermentációtól, feltárástól függően nyert kb. 1500 mg liofilizált por alakú készítményt, mint antigént titrálás után latex agglutinációs, immundiffúziós és counter-immunelektroforézises vizsgálatokhoz, továbbá a késői túlérzékenységen alapuló in vivo vizsgálathoz használhatjuk fel. 3. példa Cg3 jelű immunbiológiai készítmény előállítása Sabouraud dextróz-ferde agarra a gomba fenntartott tenyészetét oltjuk, majd 48 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A kapott ferde agar tenyészeten fejlődött gombát dextróz/pepton/élesztő levesben szuszpendáljuk, és a szuszpenziót oltótenyészetként használjuk fel a következő lépésben. 500 ml/es Erlenmeyer lombikba 250 ml folyékony dextróz/pepton/élesztő leves táptalajt töltünk, és a táptalajhoz hozzáadjuk a fentiek szerint előállított oltótenyészetet. A kapott elegyet 48 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A tenyésztés közben a lombikot 130 fordulat/perc sebességgel rázzuk. Ezután a tenyészethez annyi 30- -40 %-os vizes formaldehid-oldatot adunk, hogy a tenyészet végső formaldehid-koncentrációja 0,5 % legyen. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
