183115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Candida Guilliermondii-fertőzés kimutatására, megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmas immunbiológiai készítmények előállítására
1 183 115 2 által asszimilálható szénforrást és nitrogénforrást tartalmazó folyékony táptalajon 48—72 órán át tenyésztünk, adott esetben 2—3 újabb populáció előállításáig tovább szaporítjuk, majd a gombasejteket elkülönítjük a tenyészettől, előnyösen élettani konyhasó oldattal mossuk, mechanikai úton (így őrléssel és/vagy ultrahangos kezeléssel) feltárjuk, előnyösen élettani konyhasó oldattal extraháljuk (ez az extraktum a kívánt fehérjetartalom beállítása után antigénként alkalmazható a laboratóriumi vizsgálatokhoz), és adott esetben tisztább hatóanyag előállítása céljából az extraktumhoz szerves oldószert, előnyösen alkoholt, még előnyösebben etanolt adunk, a kapott csapadékot pedig — adott esetben további tisztítás után — immunbiológiai célokra alkalmas készítménnyé alakítjuk; vagy c) Candida guilliermondii-törzset aerob körülmények között, 24-42 °C-on, előnyösen 32-38 °C-on a gomba által asszimilálható szénforrást és nitrogénforrást tartalmazó folyékony vagy szilárd táptalajon 48—72 órán át tenyésztünk, majd a tenyészetet elöljük, az elölt sejteket elkülönítjük, végül immunbiológiai célokra alkalmas készítménnyé alakítjuk. A találmány szerinti a) és b) eljárásváltozatban kapott csapadék tisztítására ismert fehérjetisztítási módszereket (pl.: kromatográfia, ultraszűrés, dialízis, szűrési segédanyagok és detergensek alkalmazása, elektroforézis stb.) használhatunk fel. Az ultrahangos kezelés mellett a sejtek feltárását például X-press készüléken is végezhetjük. A következőkben a találmány szerinti a) eljárásváltozattal előállított immunbiológiai készítményt Cgl-gyel, a b) eljárásváltozattal előállított immunbiológiai készítményt Cg2-vel, a c) eljírásvál.tozattal előállított immunbiológiai készítményt pedig Cg3-mal jelöljük. A Cgl jelű immunbiológiai készítmény prolongált tenyésztésnek alávetett Candida guilliermondii sejtekből elkülönített, fehérjét is tartalmazó sejtkivonat. A sejtkivonat legfontosabb alkotó elemei a Candida guilliermondii toxinjai. A Cgl jelű immunbiológiai készítmény elsősorban a Candida guilliermondii fertőzés kimutatására alkalmas az intradermális próbával végzett korai túlérzékenységi immunbiológiai reakció kiváltása alapján; ugyancsak alkalmas keringő ellenanyagok kimutatására a durham-cső vagy kapilláris-cső precipitációs eljárás alapján; ezen túlmenően ez a készítmény az élő szervezetbe juttatva olyan ellenanyagok termelését indítja meg, amelyek a már kialakult Candida guilliermondiifertőzés megszüntetésére alkalmasak. A Cg2 jelű immunbiológiai készítmény — amelyet rövid tenyésztésnek alávetett Candida guillierinondiisejtekből különítünk el — a Cgl jelű immunbiológiai készítménynél lényegesen nagyobb mennyiségű fehérjét is tartalmaz, ugyanakkor toxintartalma csekély. Ez az immunbiológiai készítmény elsősorban a fertőzésveszélynek kitett élő szervezetek immunizálására alkalmas; ezen kívül diagnosztikumként alkalmazható intradermális próbával a késői túlérzékenységi immunbiológiai reakció kimutatására, továbbá antigénként használható fel a fertőzés kimutatására latex agglutinációs, immundiffúziós és counter-immunelektroforézises eljárásokhoz. A Cg3 jelű immunbiológiai készítmény elölt teljes Candida guilliermondii-sejtekből áll, és elsősorban a Candida guilliermondii-fertőzés korai stádiumának kimutatására használható fel laboratóriumi eljárásokban (például agglutináció, indirekt fluoreszcens vizsgálat), vagy ABR (Abortus-Bang-Ringprobe) típusú próbához szükséges festett antigén előállításához. (Hutyra,F.,I. Marek, R. Manninger, I. Mocsy: Spezielle Pathologie und Therapie der Haustiere. VEB. Gustav Fisher Verlag. Jena. 1959.). 5 Mindhárom immunbiológiai készítmény előállításához termelő mikroorganizmusként előnyösen a fertőzött egyedek szervezetéből elkülönített Candida guilliermondii alkalmazható sikerrel. Felhasználhatjuk azonban erre a célra az ismert nemzetközi törzsgyüjteményekből szár- 10 mazó Candida guilliermondii törzseket is, például a Centralbureau voor Schimmelcultures törzsgyűjteményben (Delft, Hollandia) CBS—566 számon letett törzset, valamint az American Type Culture Collection törzsgyűjteményben letett Candida guilliermondii-törzseket. 15 Az immunbiológiai készítmények előállításakor célszerűen a termelő Candida guilliermondii törzs aerob körülmények között, asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon, 24—42 °C-on 48—72 órán át végzett tenyésztésével kapott e!őtenyészetéből indulunk 20 ki. Az előtenyésztéshez, valamint a további tenyésztéshez asszimilálható szénforrásként a következő anyagokat használhatjuk fel: glükóz, szacharóz, maltóz, cellobióz, melibióz, melecitóz, inulin, arbutin, galaktóz, szorbóz, trehalóz, ribóz, xilóz, L-arabinóz, D-arabinóz, glicerin, 25 ribit, D-mannit, D-dulcit-, L-metil-D-glükozid, szalicin, borostyánkősav, citromsav stb. Az előtenyésztéshez, illetve a további tenyésztéshez felhasznált táptalajok asszimilálható nitrogénforrásként például a következő anyagokat tartalmazhatják: szérum, „Proteose peptone” 30 (Difco certified, Difco Laboratories, Detroit Michigan, USA) és egyéb proteózok, peptonokat és aminosavakat tartalmazó készítmények. A Cgl és Cg2 jelű immunbiológiai készítmények előállítása során a tenyésztési szakasz végén a baktérium- 35 mentességét ellenőrizzük, majd a gombasejteket célszerűen centrifugálással különítjük el a fermentlétől. Az elkülönített sejteket vízzel vagy vizes sóoldattal (előnyösen élettani nátriumklorid-oldattal) mossuk. Az elkülönített Candida guilliermondii-sejteket ezután önmagában 40 ismert mechanikai feltárásnak vetjük alá. Eljárhatunk például úgy, hogy a csapadékot szárítjuk, majd steril őrlőben őröljük, miközben az őrleményből időről időre mintát veszünk, és a feltárás mértékét mikroszkóposán ellenőrizzük. Ezt követően a mechanikailag feltárt sej- 45 teket élettani konyhasó oldattal extraháljuk. Egy másik módszer szerint az elkülönített Candida guilliermondii sejteket vízzel vagy vizes sóoldattal (előnyösen élettani konyhasó oldattal) keverjük össze, és a sejtszuszpenziót ultrahanggal kezeljük. A szuszpenzióból időről időre 50 mintát veszünk, és a feltárás mértékét mikroszkóposán ellenőrizzük. Mindkét kezelési eljárásban a mechanikai roncsolással egyidőben a vizes, előnyösen élettani konyhasó oldattal végzett extrakció is lezajlik. Ezután a szilárd anyagot (sejttörmeléket) centrifugálással eltávolít - 55 juk, a felülúszót szűrjük, és a szűrlethez alkoholt adunk. A kivált csapadékot kívánt esetben a fehérjék tisztítására felhasználható, általánosan ismert módszerekkel (pl. kromatografálással, ultraszűréssel, dialízissel, elektroforézíssel stb.) tisztíthatjuk, abban az esetben azonban, ha az 60 immunbiológiai készítményt diagnosztikai célokra kívánjuk felhasználni, nincs feltétlenül szükség a csapadék további tisztítására. Miként már említettük, a Cg2 jelű immunbiológiai készítmény esetén diagnosztikai célokra a feltárt sejtek extraktuma közvetlenül is felhasználható. 65 Az „immunbiológiai készítmény” megjelölés ezt a diag-4
