183101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vegyi anyagok mutagén hatásának kvantitatív jellemzésére in vitro körülmények között végzett vizsgálattal
1 183 101 2 tékelés céljára elég nagy koncentrációjú, pufferoldattal (pH: kb. 7,0) készített szuszpenziójához ismert mennyiségű, vízben, legföljebb 20%-os vizes alifás alkohol-oldatban vagy legföljebb 38%-os vizes dimetilszulfoxid-oldatban oldódó vagy a felsorolt oldószerekkel elegyedő vizsgálandó vegyszert adunk, a szuszpenzióból a vegyszer beadagolása után azonnal mintát veszünk és önmagában ismert módon, a megfelelő gazdasejten végzett tenyésztéssel meghatározzuk a minta kiindulási fágkoncentrációját [N(O)], a vegyszert tartalmazó fágszuszpenziót előre meghatározott hőmérsékleten, célszerűen 37 °C-on tartjuk, a szuszpenzióból időről időre mintát veszünk és önmagában ismert módon, a megfelelő gazdasejten végzett tenyésztéssel meghatározzuk a túlélő fágok koncentrációját a mintavétel időpontjában [N(t)], kiszámítjuk az egyes időpontokhoz tartozó ln[N(t)/N(0)]. hányadosokat, számítással vagy grafikus úton meghatározzuk az ln[N(t)/N(0)] = - 1 értékhez tartozó időt, és ezt az értéket szorozzuk a vizsgálandó vegyi anyag koncentrációjával. Az ismertetett vizsgálat és számítás végeredményeként kapott értéket a továbbiakban „dimérekvi.valens dózis”-nak nevezzük. A dimérekvivalens dózis minden egyes vegyületre nézve állandó érték, és kvantitative jellemzi a vegyidet mutagén hatását. A dimérekvivalens dózis és a mutagén hatás egymáshoz képest fordított arányban változik; azaz minél nagyobb egy adott vegyület dimérekvivalens dózisa, annél kisebb a vegyület mutagén hatása. A szemléletesség érdekében a gyakorlatban a mutagén hatás jellemzésére a dimérekvivalens dózis helyett célszerű ennek az értéknek a reciprokát használni, amely a mutagén hatással azonos irányban változik. Ha a reciprok skálát használjuk fel a mutagén hatás jellemzésére, és az időt percben, a vizsgálandó vegyi anyag koncentrációját pedig mól/liter egységekben vesszük figyelembe a számításkor, akkor 0 és 1 között a nem, illetve kevéssé veszélyes, 1 fölött pedig az erősen mutagén anyagok helyezkednek el. Tekintettel arra, hogy a fág inaktiválódásához vezető kémiai reakciókra a nagy számok törvényei érvényesek, a dimérekvivalens dózist megbízható pontossággal csak akkor tudjuk megállapítani, ha igen nagy számú vizsgálati objektumot (fágot) vonunk be a kísérletbe. Tapasztalataink szerint megbízható eredmények eléréséhez célszerűen körülbelül 107 fág/ml koncentrációjú fágszuszpenziókból kell kiindulnunk. Tekintettel arra, hogy a fágok csak vizes közegekben tarthatók el, a kísérleteket csak vízben oldható vagy vízzel elegyedő vegyszerekkel hajthatjuk végre. A fágok pH-érzékenységét figyelembe véve nem hajthatjuk végre a kísérleteket olyan vegyszerekkel sem, amelyek a puffer pH-ját 6,0 alá csökkentik. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa /?, vitamin mutagén hatásának meghatározása Foszfátpufferrel (pH = 7,0) készített 2 ml T7 fagszuszpenzióhoz, amelynek koncentrációja 1.107-5.107 fág/ml, azonos mennyiségű, 37 °C-ra felmelegített foszfátpufferben oldott 0,1 mól/1 (27,8 g/1) B, vitamint adunk. A szuszpenzióból azonnal, mintát veszünk, és a későbbiekben ismertetésre kerülő eljárással meghatározzuk a kiindulási fágkoncentrációt [N(O)]. A szuszpenziót 37 °C-ra felfűtött termosztátba helyezzük, és a szuszpenzióból az inkubáció kezdetétől számított 45, 90, 135, 180, 300 és 360 perc múlva 0,05 ml térfogatú mintát veszünk a B! vitamin hatását túlélő fágok koncentrációjának [N(t)j meghatározására. Kontrollként a B, vitamin hozzáadásától eltekintve mindenben azonosan kezelt T7 fágszuszpenziót használunk. A kontroll szuszpenzióból a B! vitaminnal inkubált szuszpenzióval azonos időpontokban veszünk mintát. Összesen 6 mintavétel után a kísérletet leállítjuk. A fágkoncentrációt az általunk módosított (Karczag: Disszertáció, 1976; Karczag, Fidy, Aczél: Studia Biophys. 30, (1972), Rontó: Disszertáció, 1979) Gratia-féle bírálással (Adams: Bacteriophages, întersci. New York (1959)) az alábbi módon határozzuk meg: A kivett mintákat foszfátpufferrel első lépésben 5 ml-re, majd az első hígításból kivett 0,05 ml mintát ismét 5 ml-re hígítjuk. A második hígításból kivett 0,1 ml mintát 1,5 ml híg ugarral és 0,5 ml E. coli B/r gazdasejt-szuszpenzióval (szuszpendáló közeg: húsleves táptalaj, koncentráció: 108/ml) keverjük össze, és a keveréket Petri csészébe töltjük. A hígítás a biológiai bíráláshoz akkor helyes, ha egy-egy Petri-csészébe 50 — 300 aktív fág kerül. A biológiai titrálást célszerűen 4-5 ismétlésben végezzük. A felszíni agar megdermedése után a Petri-csészéket 2-3 órán át 37 °C-os termosztátban inkubáljuk. Az inkubáció végeztével az egyes Petri-csészékben a letális mutációt nem szenvedett fágok helyét egy-egy tarfolt jelzi; a tarfoltok száma tehát a mintavétel alkalmazásával a Petri-csészére juttatott aktív fágok számát adja meg. Az azonos mintavételekből végzett titrálásokban kapott tarfoltok számát átlagoljuk, és a hígítási arányokból kiszámítjuk, hogy a kivett minta eredetileg hány ép fágot tartalmazott. A minta mennyiségéből a szuszpenzió térfogatához viszonyítva számítjuk ki a túlélő fágok mennyiségét [N(t)]. Minden egyes mintavételi időpontra kiszámítjuk az ln[N(t)/N(0)] tört értékét, és ezt az értéket az idő függvényében grafikusan (célszerűen féllogaritmusos koordinátarendszerben) ábrázoljuk. Az így kapott dózis-hatás görbének kezdeti szakaszát egyenessel közelítve grafikusan meghatározzuk az ln[N(t)/N(0)] = — 1-hez tartozó inkubációs idő értékét (percben kifejezve). Ezt az inkubációs időt (291 perc) a B, vitamin mól/l-ben kifejezett koncentrációjával (0,2 mól/1) szorozva a dimérekvivalens dózist kapjuk, amelynek értéke 29 mólperc/1. A dimérekvivalens dózis reciproka 0,017 liter/ mól.perc. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
