182997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított intakt erithrociták előállítására
1 182 997 2 Tárolt emberi vörös vérsejtek IHP-felvételének kinetikája A 14. ábra az eritrociták oxigénnel szemben mutatott, időtől függő affinitásának csökkenését mutatja inozit-hexafoszfáttal töltött V2 vesikulumokkal 0,19 mólos IHP-oldatban 7,35 pH-értéken történő inkubálás után. A Po2(l/2) emelkedése 4 perc után maximális értékének a felét éri el. Az IHP-felvétel kinetikája — melyet a P02(l/2) növekedéseként mérünk - az inkubációs közeg pH-értékétől függ. A 15. ábrán az IHP beépülés felezési idejét a pH-érték függvényében ábrázoljuk. Az IHP felvétele alacsony" pH-értéken (pH 7,3) lassúbb és magasabb pH-értéken (pH 7,7) gyorsabb a reakció. A felvétel magasabb pH-értéken fellépő rövidebb felezési ideje az eritrocitákba beépülő IHP nagyobb mennyiségének felel meg (lásd 6. és 13. ábra). Az IHP beépülésének kinetikáját erősen befolyásolja a szabad IHP jelenléte a külső közegben. A szabad IHP dialízissel vagy a vesikulum-szuszpenzió gélszűréssel történő eltávolítása az IHP-felvétel felezési idejének 30 percre történő meghosszabodásához vezet, pH 7,4 értéken (lásd 16. ábra). ATP-koncentráció inozit-hexafoszfáttal töltött eritrocitákban Az eritrociták adenozintrifoszfát-tartalma (ATP) a vörös vérsejtek konzerválása és kifogástalan működése szempontjából nagy jelentőségű. Az ATP-koncentrációt olyan vörös vérsejteken mérjük, melyekbe a korábbiakban leírt körülmények között üres V2 vesikulumokat és inozit-hexafoszfáttal töltött V2 vesikulumokat építettünk be. Valamennyi mérést 0,1 mólospH=7,4 értékű izotóniás bisz-irisz-pufferben végezzük el. Az ATP- koncentrációt luciferin-luciferáz-rendszeren mérjük: enzim + luciferin + ATP ''E -S—AMP + pirofoszfát (E) (S) ---------—--------—1 02 E + oxidált szubsztrátum + AMP + CO + h A reakció olyan hatékony, hogy minden felhasznált ATP-molekulára egy proton képződik. Az üres vagy inozit-hexafoszfáttal töltött vesikulumok beépülése az erítrocitákban fellépő ATP-koncentrációra nem fejt ki jelentősebb hatást. II. táblázat Eritrociták A TP-tartalma ATP juM/ml WS Eritrociták 0,92 ±10% Eritrociták —V2 0,84 Eritrociták-V2-lHP 0,93 Ezek az értékek egy hetes vörös vérsejtekre vonatkoznak. Az a körülmény, hogy az ATP-koncentráció a vörös vérsejtekben az IHP felvétel után nem változik arra utal, hogy a vörös vérsejtek életképessége, funkcionalitása és plaszticitása változatlan. 0-, -felszabadulás inozit-hexafoszfáttal töltött vesikulumok na k eritrocitákkal történő egyesülése útján Az oxigén-megkötési görbék IHP-felvétel után történő .jobbra tolódását” a 17. ábrán tüntetjük fel. A pH=7,4 értékű izotóniás bisz-trisz-pufferben szuszpendált 41 napos eritrocitáknak az inozit-hexafoszfáttal töltött V2-vesikulumokkal való egyesülése után az oxigén-féltelítettségi nyomás 7 Törr-ról 28 Torr-ra emelkedik. Ez azt jelenti, hogy a normál azonban megöregedett eritroriták 25 °C-on 30 Torr oxigén parciális nyomás alatt oxigénnel 95%-ig töltve vannak, míg az inozit-hexafoszfáttal töltött eritrociták hasonló körülmények között csupán 53%-ig tartalmaznak oxigénnel töltött hemoglobint. Az inozit-hexafoszfáttal töltött vesikulumokkal való fúzió után az erítrocitákban a hemoglobin kb. (>0%-a kötődik az eritrocita- IHP-val. Fiziológiai körülmények között (37 ,°C-on) pH = 7,4 értéken az inozit-hexafoszfáttal töltött eritrocitákra számított oxigén-féltelítetuégi nyomás 60 Torr. 30 Torr kritikus oxigén parciális nyomás alatt az agyban a vesikulummal kezelt eritrociták hemoglobinjának 80%-a a megkötött oxigént leadná, míg a kezeletlen normál eritrociták ilyen körülmények között az oxigénnek csupán 20—25%-át adnák le. Az eritrociták hatékony affinitása a lenti két határ között a lipid-vesikulumokban levő IHP koncentráció, vagy a vérben levő kezelt és kezeletlen eritrociták arányának megváltoztatásával variálható. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az inozit-hexafoszfátnak az eritrocitákba történő találmányunk szerinti beépítésével a hemoglobin oxigén-affinitása az intakt sejtekben hosszan tartó, erős és szabályozott módon csökkenthető. Az ily módon inozit-hexafoszfáttal töltött eritrociták különösen a fent említett esetekben bizonyullak alkalmasnak a szöveti oxigénellátás szabályozására. Patkányok és egerek hozzászoktatása nagy magassághoz 200 gr súlyú és 14 ml vértérfogatú (Po2(l/2)=14,0 Torr 25 °C-on és pH=7,4 értéken) patkányt csökkenő oxigén parciális nyomás mellett kamrában tartunk. 120 'rorr oxigén parciális nyomásnál — ez 13 200 m-es magasságnak felel meg — a patkány a végtagok izmaiban fellépő oxigénhiány miatt támolygás után a földre roskadt. A kamrában levő oxígénnyomást ezután gyorsan normális értékre állítjuk be, mikor is a patkány normális viselkedést mutat. Az állatból 1 ml vért veszünk. Az eritlocitákat izoláljuk és a fentiekben leírt módon inozithexafoszfáttal töltjük. Az inozit-hexafoszfáttal töltött ( ritrocitákat a plazmában ismét szuszpendáljuk (Po20/2)=28,0 Torr 25 °C-on és pH=7,4 értéken) és a patkány szervezetébe visszavezetjük. Ezután az oxigén parciális nyomását ismét csökkentjük és a patkány 100 Tgmm parciális nyomásnál (kb. 14 200 m-es magasság) ogyott a földre. A kezelés eredményeként tehát az állat íltal elviselt magasság felső határa +8%-al változott. \ magassághoz való alkalmazkodási kísérletet ezzel a patkánnyal 24 óra múlva megismételtük és ugyanezt az eredményt kaptuk. Másik kísérletben 9 kg súlyú és 630 ml vértérfogatú i.Po2(1/2) = 1 0,0 Torr 25 °C-on és 7,4 pH-értéken) kutyát kamrába zárunk, melyben az oxigén parciális nyomását esökkentjük. A kutya 140 Torr oxigén parciális nyomás mellett (ez 12 200 m-es magasságnak felel meg) rogy a 'oldre. A kamrában az oxigénnyomást gyorsan a normál értékre állítjuk be, mikor is a kutya normális viselkedést mutat. A kutyától 100 ml vért veszünk. Az eritrocitákat a „módszerek” fejezetnél leírt módon izoláljuk és inozithexafoszfáttal töltjük. Az inozit-hexafoszfáttal töltött eritrocitákat ismét a szérumban szuszpendáljuk (Po2(l/2)/=15,0 Torr 25 °C-on és pH=7,4 értéken), majd 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
