182997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított intakt erithrociták előállítására
1 182 997 2 Széndioxid távollétében az inozit-hexafoszfáttal töltött V2 vesikulumokkal szabad 1HP jelenlétében 7,6 pH- értékben inkubált és a megfelelő izotóniás 0,1 mólos pufferrel történő mosással a kívánt pH-értékre beállított eritrociták uohr-effektusa -AP02(1/2)A, pH=l,20. Az inozit-hexafoszfáttal töltött eritrociták Bohr-proton leadása háromszor nagyobb, mint a normál friss vörös vérsejteké. Ezért az inozit-hexafoszfáttal töltött sejtek a szövetekben hatékonyabb oxigénleadást és a tüdőben hatásosabb oxigénfelvételt idéznek elő. Az inozit-hexafoszfát beépülése az inozit-hexafoszfáttal töltött V2-vesikulumokkal szabad inozit-hexafoszfát jelenlétében 7,8 pH-értéken sokkal hatékonyabb. Miután az inozit-hexafoszfáttal töltött sejtek pH-értékét 7,4-re változtattuk, az elméletileg várható emelkedés Po2(1/2)=35 Torr értékre figyelhető meg (lásd 6. ábra). Másrészről a Bohr-effektus 7,8 pH-értéken való beépülés után kisebbnek látszik (—APo,(l/2)~)ApH=0,9 proton mól 02). A vesikulum összetételének hatása az emberi eritrociták által történő inozit-hexafoszfát felvételére Az oxigén megkötési görbe .jobbra tolódása” az emberi eritrociták által felvett inozit-hexafoszfát mennyiség mértékeként szolgál. A standard körülmények között mért oxigén-féltelítettségi nyomás így az inozit-hexafoszfát beépülés hatásfokának kifejezője. Az inozit-hexafoszfát felvétel hatásfoka messzemenően függ a vesikulum lipid összetételétől. A 7. ábrán a VI és V2 vesikulumok 7,6 pH-értéken történő inkubálás utáni oxigén-megkötési görbéjének .jobbra tolódását” mutatjuk be. A V2 vesikulumok a legerősebb .jobbra tolódást” 14%-os leadás mellett 30 Torr-nál mutatják. A 19 napos eritrociták ennél az oxigénnyomásnál nem mutatnak leadást, míg a friss vörös vérsejtek leadása 5%-ig teijed. Az inozit-hexafoszfát V2 -vesikulumokkal történő beépítése a normál vörös vérsejtek 30 Hgmm-nél való oxigénleadását kb. 3-as faktorral javítja. A V2- és V3-vesikulumok az eritrociták által történő ugyanilyen IHP-felvételt és az oxigénmegkötésigörbék ugyanilyen .jobbra tolódását” idézik elő. Amennyiben a külső közeg inozit-hexafoszfátot nem tartalmaz, a VI-, V2- és V3-vesikulumok — melyek inozit-hexafoszfátot felvettek — felezési idejükben nem különböznek:, r1; 2 30 perc. AVI- és V3-vesikulum a dializált, inozit-hexafoszfáttal töltött V2-vesikulumra mért IHP-hatás felénél kisebb értéket ad. Ez a VI- és V3-vesikulumok csökkentett stabilitására utal. A 8. ábrán a V2- és V3-vesikulumok stabilitása közötti különbséget mutatjuk be. A stabilitás felezési ideje V2 vesikulumoknál kb. 3 nap és V3-vesikulumoknál kb. 1,5 nap. Vesikulumok beépítése a vérsejtekbe A lipid-vesikulumoknak intakt eritrocitákba történő felvételét 14 C-kolesztejinnel vagy ! 4 C-foszfatidil-kolinnal jelzett VI, V2 és V3 vesikulumokkal követjük nyomon. Ezt ugyanannak a vesikulumnak tenyésztett Hela-sejteken való felvételével hasonlítjuk össze. A radioaktivitást az intakt eritrocitákban (Lumac-reagens-set segítségével való oldhatóvá tétellel és elszíntelenítéssel) és a teljes lipid-extraktumban mérjük. A beépülést 4 órán át követjük nyomon. Az eredményeket a 9. és 10. ábrán tüntetjük fel. A 9. ábrán a VI, V2 és V3 vesikulumokra intakt eritrocitákkal kapott eredményeket tüntetjük fel. Az inkubációs közeg 10 ml vörös vérsejiet és 10 ml inozit-hexafoszfáttal töltött vesikulumot tartalmaz 0,1 mólos 7,4 pH-értékű izotóniás bisz-trisz-pufferben. Alikvot részeket 10, 20, 40, 60, 90, 120, 180 és 240 perc múlva veszünk és megszámlálunk. A beépülés felezési ideje V2 vesikulumok esetében — mely a vörös vérsejtekben a legnagyobb radioaktivitást mutatja — 45 perc, míg a VI és V3 vesikulumok esetében 35 perc. Hangsúlyozni kívánjuk, hogy a vörös vérsejtekben talált radioaktivitás nem feltétlenül jelenti a vesikulum-felvételt, minthogy ismeretes [Bloj B. és Zilversir.it D.: Biochemistry' 16 (1977) 3943-3948], hogy a koleszterin a vesikulumok és eritrociták között kicserélődik. A vörös vérsejt lipid-extraktumokban (lásd 10. ábr vesikulumok felhasználása esetében 30 perces felezési időt találtunk. Amennyiben V2 és V3 vesikulumi ’ Hela-sejtekbe építünk be, hasonló képet kapunk (!.■ . 11. ábra). A Hela-sejteknek a vesikulumokkal törten ; inkubálását a fentiekben leírt körülmények közöl végezzük el. További kísérlet-sorozatban Hela-sejtek 14C-koleszterint tartalmazó vesikulumokkal izotón: pufferekben 7 és 8 közötti különböző pH-értékeken inkubálunk. A 12. ábra azt iputatja, hogy a 7 és 8 közötti pH változtatás a jelzett lipideknek a sejtekbe való beépülését csak kevéssé befolyásolja. A radioaktív jelzett vesikulumokkal inkubált eritrociták radioaktivitás felvételének felezési ideje megegyezik a dializált inozit-hexafoszfáttal töltött vesikulumokkal inkubált eritrociták IHP-felvételének felezési idejével (16. ábra). Ez további bizonyítéka annak, hogy nem csupán a vérsejtek és vesikulumok közötti lipid-cserét, hanem a vesikulumoknak a vérsejtekkel való egyesülését is mérjük. Az eritrociták lipid-extraktumának vékony rétegkromatogrammjai a vörös véisejtek membrán-lipidjeinek a vesikulumok lipidjeiben való feldúsulását mutatják. Tárolt emberi vörös vérsejtek V2 által közvetített IHP felvételének látszólagos pH-optimuma Az inozit-hexafoszfátnak mosott eritrociták által történő felvétele az inkubációs közeg pH-értékétől függ. Az inozit-hexafoszfáttal töltött eritrociták Po2(l/2) értékének az inkubációs közeg pH-értéke függvényében való grafikus ábrázolása (13. ábra) az IHP felvételének a 7,4—7,5 pH-intervallumban való jelentős optimumát mutatja. APo2(l/2) érték 7,5 pH fölött bekövetkező csökkenése a Bohr-effektus 6. ábrán feltüntetett görbéjének felel meg és az IHP hemoglobinnal szemben mutatott affinitás-csökkenésével kölcsönhatásban áll. 7,4 alatti pH-n a Po2(l/2) drasztikus csökkenése korlátozott IHP-felvételre utal úgy, hogy a teljesen átalakult hemoglobin elméletileg várt Pq2(1/2) értéke nem volt megfigyelhető. A puffer-közeg pH-értékének 7,4-re történő változása a pH=7,8 értéken végzett inkubálás után a hemoglobin Pq2(1/2) értékét az eritrocitákon belül 25 °C-on 30—40 Torr-ig növeli (lásd 6. ábra). A 7,8 értéken történő inkubálás és a különböző pH-értékekre történő pufferolás az egész pH-tartományban a Po2(l/2) érték növekedéséhez vezet. Ebből az eredményből az a végkövetkeztetés vonható le, hogy az IHP-beépülése az eritrocitákba 7,4 PH felett hatékonyabb, bár alacsonyabb pH-értéken is hatásos. 5 10 15 20 25 30 35 43 45 50 55 60 65 7
