182997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított intakt erithrociták előállítására
1 182 997 2 Diabetes mellitus, az eritrocitákban fellépő enzimdefektusok). 7. A méregtelenítési folyamatok jobb oxigénellátással való meggyorsításánál. 8. Konzervált vér oxigén-affinitásának csökkentésekor 5 (transzfúzió, sokk állapotok). Rák besugárzással való kezelésének megjavítása céljából. Az eritrocitákba irányuló szállításhoz elsősorban olyan alloszterikus effektorok jöhetnek tekintetbe, te melyek a hemoglobinhoz nagyobb affinitást mutatnak, mint a 2.3-bisz-foszfoglicerát és adenozintrifoszfát fiziológiai effektorok. Az alloszterikus effektorok közül az inozit-hexafoszfát különösen előnyösnek bizonyult. 15 Alloszterikus effektorként továbbá más cukor-fosztátok (pl. inozit-pentafoszfát, inozit-tetrafoszfát. inozittrifoszfát. inozit-difoszfát és difoszfatidil-inozit-difoszfát ) alkalmazhatók. A további alloszterikus effektorok közül az egyéb 2C polifosz.fátok (pl. nukleotid-trifoszfátok, nukleotiddifoszfátok. nukleotid-monofoszfátok és alkohol-foszfát-észter) említjük meg. Bizonyos hemoglobin-mutációk esetében (pl. ,,Zurich''-hemoglobin) alloszterikus effektorként szerves 25 anionok (pl. polikarbonsavak) is felhasználhatók. Ezenkívül alloszterikus effektorként szervetlen anionok (pl. hexacianoferrát. foszfát és klorid) is felhasználhatók. Lipid-vesikulumként foszfátidilkolin (foszfatidil- 3C szerin) koleszterin 10 5 : 4 - 1 : 10 3 mólarányú keverékeit alkalmazhatjuk. Különösen előnyösen használhatunk egy 8:2:7 mólarányú keveréket, azonban a 9 : 1 :8 és 8 : 4 : 7 mólarányú keverékek is kedvezőek. Folyékony hordozófolyadékként a szakember szá- 35 mára minden további nélkül ismeretes szokásos hordozofolvadékok alkalmazhatok (különösen pufferolt fiziológiai hordozófolyadékok, pl. í/otoniás hisz-tris/-puffer4. A lipid-vesikulumnak az eritroeitak membránjával valói egyesülésre képesnek keli lennie. Az ailosztei ikus 4(7 effektoroknak az intakt eritrocitákba való beépülése lehetővé teszi azt. hogy a hemoglobin az eritrocitákban az oxigént sokkal könnyebben leadó alloszterikus konformációba menjen át. Találmányunk segítségével a ver jobb oxigénkihász- 45 nálását biztosító módosított erimviiak ho/halók létre. E módosított eritrocitákat oly máidon hozzuk létre, hogy az eritrocitákba lipid-vesikulmnok segíiségevel irreverzibilis módón alloszterikus ellektoiok.it építünk be. mimellen a lipid-\esikuitimok az -.■niiociták sejt- 5C membránjaival egyesülnek es az allosztciikus eflekiorok az eritrocitákban a hemoglobinhoz kötődnek. Amennyiben alloszterikus effekmrkeni pl. mozithexajmzfátot használunk, a lipid-vesikulumok eifihh az ifit 'zi! -hcxüfi hl! töltődnek, majd az era> roL ilakk al 55 egyesülnek, miko/ben az inoztt-hïxuto\zjüt a hemoglohinhez kötődik és ezáltal a hemoglobin alloszt*'nkus konformációja, valamint oxigénhez való affinitása megváltozik. Az alloszterikus effektorok és a lipid-vesikulumok Gf kombinációját extrakorporálisan épitjuk he az eriirocitákba. A találmányunk szerinti eljárással előállttól! a módosított entrocit.iknak külonho/n betegségek ellen felhasználható gyógyszerek készítésére alkalmazhatok. A felhasználás során a levett vértől elválasztott eritrocitákat a lipid-vesikulumok és alloszterikus effektorok kombinációjának beépítésével módosítjuk, majd a módosított eritrocitákat a vérplazmába ismét visszavisszük. Fentiek segítségével módosított eritrocitákat tartalmazó vérkonzervek vagy vérkészítmények állíthatókelő, melyek mindazon esetekben felhasználhatók, melyekben a véráram végső szakaszában fokozott oxigénleadásra, illetve a szövetek oxigénkihasználásának javítására van szükség. A módosított eritrocitákat fiziológiailag megfelelő hordozófolyadékban meleg vérűek vérkeringésébe intravénásán is bevezethetjük. A módosított eritrociták előállításának előnyös kiviteli alakját az alábbiakban részletesen ismertetjük. Jobb oxigénleadást biztosító módosított eritrocitákat előnyösen cly módon állíthatunk elő. hogy 1. inozit-hexafoszfátot az oldat telítődéséig izotóniás puffer-oldatban oldunk; 2. a kapott oldatban foszfatidil-kolin. foszfatidil-szerin és koleszterin 10 5:4 1:10 3 mólarányú lipid - keverékét szuszpendáljuk; 3. a kapott szuszpen/iót a fázisátmeneti hőmérsékletnél magasabb hőmérsékleten, kis unilamelláris vesikulumok képződése közben ultrahanggal történő dezintegrálásnak vetjük alá: 4. a keveréket centrifugáljuk, a felül elhelyezkedői ino/jt-hexafoszfátban feldúsított kis lipid-vesikulumokat és a szabad inozit-hexafoszfátot tartalmazó szuszpenziót elválasztjuk; 5. a vérplazmától előzetesen centrifugülással és mosással elválasztott emberi eritrocitákat a felül elhelyezkedő, inozit-hexafoszfatban feldúsított kis hpid-vesikulumokat és szabad inozit-hexafoszfaiot tartalmazó szuszpenzióban szuszpendáljuk: (■>. a kapott szuszpenziót 10- A"7 T-os hőmérsékleten inkuháljuk. és 7. az eritrocitákat izotóniás konyhasó-oldattal vagy izotóniás pufterrel mossuk és az inkubációs közegtől kvantitatívon megszabadítjuk es vérplazmában, illetve vérplazmát pótló oldatban szuszpendáljuk. Találmányunk további rés/leteii az ábrák segítségével matatjuk he. melyeken a VYS jelölés a vörös vét sejteket jelenti. Az Fábián az eritrocilákban levő hemoglobin oxigén-affinitásának a 4 (7-on történő tárolási idő függvényében bekövetkező emelkedését grafikusan ábrázoljuk. \z ox igén-fél te I í te 11 végi nyomást , P0.( 1 .;2)> 25 i on széndioxid távollétiében mérjük. \z \Cl)-ben konzervált vörös vérsejtek jelzőse —r:.-n-m a U.l mólos 7.4 pH-értékii. 0.154 nini lile; n.itriumkloridot tartalmazó M>/-trisz-pufferhen tárolt YYS-ek jelzése OOOO \ 2. ábrán az eritrocitákban levő hemoglobin oxigénmegkötési görbéjének ..balratolodását" mutatjuk be a 4 ( -011 való tarolás idejének t'uggvénv eben. \ vörös verseiteket 0.10 mólos pH 7.4 értékű. 0.154 mól liter nutviuinklorid tartalmú izotóniás hiyMrisz-putterben 4 C- 011 tanújuk. A megkötési izotermáikat 25 C-on széndioxid távollétéhen mórjuk.--------------------: politoszfátoktól teljesen megszabadított vörös vérsejtek; : polifoszfátban való elszegényedes felezési idejének megfelelő vörös vérsejtek ( 7] ;2 =9 d); 3
