182997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított intakt erithrociták előállítására
1 182 997 2 A találmány tárgya eljárás módosított intakt eritrociták előállítására. Az eritrociták egyik fő feladata a molekuláris oxigénnek a tüdőből a perifériás szövetekhez történő szállítása. a eötrociták nagy koncentrációban hemoglobint (a • cvábbiakban Hb) tartalmaznak (30 pg sejtenként = 35,5 g (100 ml sejt), mely az oxigénnel reverzibilis adduktot képez. Az oxigén parciális nyomása a tüdőben kb. 100 Torr és a kapilláris rendszerben kb. 70 Torr; az oxigénnek az oxigénnel töltött hemoglobinból ezzel a nyomással szemben kell disszociálni. Fiziológiai körülmények között az oxigénnel töltött hemoglobinnak csupán mintegy 25%-a képes az oxigént leadni. Ezért kb. 75%-a vénás vérrel a tüdőbe visszakerül, következésképpen a Hb -02 -addukt nagyobb része az oxigénszálbíás szempontjából kihasználatlan marad. A Hb 02 -adduktból maximális oxigénleadás biztosítása a kapilláris rendszerben a lehető legmagasabb oxigén parciális nyomás egyidejű fenntartása mellett fiziológiai kövételmény; az ehhez való alkalmazkodást a hemoglobin és az alloszterikus effektorok közötti kölcsönhatások biztosítják. A hemoglobin alloszterikus tulajdonságai felelősek az oxigénmegkötési görbe szigmoid alakjáért. Az 02 -affinitás mértékének a féltelítettségi nyomást (P0 2( 1/2)) tekintik. A szigmoid-alakú görbének a 40—60?-os telítettségi tartományban való emelkedése jelenti a Hb-ben lévő négy 02 -megkötési hely együtthatásának mértékét (Hill-koefficiens:n=2.8-3,2). A Hill-koefficiensek emelkedése - azaz a szigmoid-alakú megkötési görbe meredekebb lejtése vagy a teljes megkötési görbének nagyobb O; parciális nyomás felé történő eltolódása (úgynevezett „jobbra eltolódás”) — a kapillár rendszerben könnyebb oxigén-leadáshoz és a körülvevő szövetek jobb oxigénellátásához vezetne. A „jobbra eltolódást” in vivo az eritrocitákban a 2,3 bisz-foszfoglicerát koncentráció emelkedése és hemoglobinhoz való kötődése biztosítja. A 2,3-bisz-foszfoglicerátnak a Hb-hoz való kötődése a 02 -affinitást csökkenti és az 02 -féltelítettségi nyomást növeli. A glikolízis-,,bypass” során az eritrocitákban képződő 2,3-bisz-foszfoglícerát az oxigénhiányhoz való lassú alkalmazkodást idézi elő. A 2,3-bisz-foszfoglicerát 7,4 pH-értéken az. izolált hemoglobin féltelítettségi nyomását Pq,( l/2)~9,3 Torr (37 cC) és 4,3 Torr (25 °C) értékről P02( 1/2)==23,7 Torr (37 °C), illetve 12,0 Torr (25 °C) értékre növeli. [K. Imái és Yonetani T.: J. Biol. Chem. 250 (1975) 1093 1098]. Az 02-affinitás jelentősen nagyobb mértékű csökkenését - azaz az 02 -féltelítettségi nyomás növekedését — izolált Hb-on növényi szövetekből izolált mozít-hexafoszfát (fitinsav, IHP) megkötésével érték el IRuckpaul K. és mtsai: Bichim. Biophys. Acta 236 (1971) 211—221]. Az IHP-nek a Hb-on való megkötése az 02-féltelítettségi nyomást Po2( 1/2) = 96,4 Torr (37 °C), illetve PÜ2( 1/2) =48,4 Torr (25 cC) értékre növeli. Az IHP - a 2,3-bisz-foszfogliceráthoz és más polifoszfátokhoz hasonlóan — nem képes áthatolni az eritrocita-membránon, A lipid-vesikulumok (hólyagcsák) a sejtmembránok bizonyos tulajdonságait tükrözik vissza. A sejtekbe a sejtplazmamembránnal való egyesülés vagy endocitózis útján jutnak be [Papahadjopoulos D. és mtsai: Nature 252 (1976) 163—165], Az egyesülés több membránfolyamatnál fontos szerepet játszik; pl. a szinaptikus átvitelnél, a kiválasztásnál, a plazmamembrán képzésénél és a membránvirusokkal való fertőzésnél. A sejteknek lipid-vesikulumokkal való egyesülését mind a sejttenyészetekben, mind az eritrocita-„szellemeknél” (sejttartalom nélküli eritrocita membránok) megfigyelték. 5 IgG-tartalmú vesikulumokkal rendelkező ML-sejtek (egér sejttörzs-limfóma) Coxsackie A—2 L vírussal szembeni magas semlegesítő titerrel történő kezelésével a sejtek a‘fenti vírussal való fertőzéssel szemben megvédhetők. Gregoriadis és Buckland [Nature 235 (1973) 10 252—253] lipid-vesikulumot használt invertáz-hiányban szenvedő egereken invertáznak a makrofágokba történő beépítésére. In vivo kísérletek azonban nem vezettek egyértelmű eredményekhez, mivel a lipid-vesikulumok kivétel nélkül minden sejtbe beépülnek vagy a májban 1 g nagyon gyorsan lebomlanak. Lipid-vesikulumoknak allosztérikus effektorok vágymás anyagok az eritrocitákba való beépítésére történő felhasználását mind ez ideig még nem írták le. Számos kísérlet azt mutatta, hogy a lipid-vesikulumok állatokba 20 biztonságosan veszély nélkül befecskendezhetők. Az inozit-hexafoszfátnak az izolált Hb szerkezetére és funkciójára kifejtett hatását részletesen vizsgálták. Ezzel szemben nem ismeretesek adatok az IHP-nak Hb-al intakt eritrocitákban mutatott kölcsönhatásáról, 25 minthogy mind ez ideig nem volt lehetséges az IHP-nak intakt eritrocitákba való bevitele. Meglepő módon azt találtuk, hogy az eritrocitamembránnal való egyesülésre képes töltött fluid lipidvesikulumok segítségével allosztérikus effektorok (pl. 30 inozit-hexafoszfát, IHP) az eritrocitákba szállíthatók, ahol sokkal nagyobb megkötési állandójuk révén a 2,3- bisz-foszfoglicerátot megkötési helyén a Hb-ban kiszorítja és irreverzibilis módon bekebelezi. Ilyen körülmények között a Hb az eritrocitákban az oxigénhez 35 lényegesen kisebb affinitással rendelkező allosztérikus konformációba megy át. A találmányunk tárgyát képező eljárás szerint módosított intakt eritrocitákat oly módon állítunk elő, hogy inozit-hexafoszfáttal töltött lipid-vesikulumokat a fázis- 40 átmeneti hőmérsékletnél magasabb hőmérsékleten 7,2 és 8,6 közötti pH-értéken az eritrocitákkal egyesítünk, majd kívánt esetben az eritrocitákat tisztítjuk. Az 02 -affinitás csökkenése — azaz a Hb 02 -féltelitettségi nyomásának növelése az eritrocitákban - fokozza az 45 eritrociták azon képességét, hogy a megkötött oxigént nagyobb 02 parciális nyomással szemben leadják és ezáltal a szövetekhez vezető oxigénszállítást javítják. Beépített inozit-hexafoszfátot tartalmazó és ezáltal a szövetekhez vezető oxigénszállítást javító eritrociták az 5C alábbi esetekben alkalmazhatók: 1. Alacsony oxigén-parciális nyomású belélegzett levegő esetében: hegymászók nagy magasságokban, asztronóták oxigénben szegény atmoszférában. 2. Csökkentett 02-kicserélési felületek esetében: tüdő-55 hólyagok számának csökkenése tüdőtáguláskor. 3. A tüdőben az oxigén-diffúzióval szemben fellépő nagyobb ellenállás esetén (tüdőgyulladás, asztma). 4. Csökkent oxigénszállítás esetében (eritrofénia, bármilyen fajta anemiás állapotok, arteriovénás ellen-60 állás). 5. Vérkeringési zavaroknál: (arterioszklerózis, tromboemboliás folyamatok, szervi infarktus, vérszegénység). 6. A hemoglobin oxigénhez mutatott nagy affinitása esetében: hemoglobin-mutációk, a hemoglobinláncban 65 lévő N-végállású aminosavak kémiai módosításai (pl. 2
