182981. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz koncentrátum előállítására mosóporhoz
1 182 981 2 A későbbiek során részletezett gátlási vizsgálatok azt mutatták, hogy — a szubtilizinnel ellentétben — a C komponens nem szerin-proteáz. A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a szubtilizin komponens allergén hatása lényegesen kisebb, mint a C komponensé. A találmány szerinti proteáz koncentrátum proteolitikus aktivitásának legalább 99%-át a szubtilizin izoenzim rendszer biztosítja, és benne a nem-proteolitikus peptidek mennyisége legalább 0,5 súly%, célszerűen 2—15 súly%, a proteolitikus aktivitása 2—20, előnyösen 5—15 Anson egység és lényegében mentes a nem szerinproteázoktól és a koncentrátumban a proteázokat a fermentléből származó nem-proteolitikus peptidek stabilizálják. A találmány szerinti proteáz koncentrátum lényegében mentes a nem szerin-proteázoktól, és csökkentett allergén hatással rendelkezik a nem szerin-proteázokat tartalmazó proteáz koncentrátumhoz képest és így előnyösen alkalmazható mosóporokban. A találmány szerinti proteáz koncentrátumot úgy állítjuk elő, hogy Bacillus licheniformis törzset — amelynek mutációja olyan, hogy gyakorlatilag - a szubtilizin kivételével — blokkolt a proteázokat szintetizáló képessége — asszimilálható szén-, nitrogén- és foszforforrást tartalmazó táptalajon fermentálunk, majd a szubtilizint és a fermentlétől származó peptideket tartalmazó proteáz koncentrátumot elkülönítjük. Az elkülönítést önmagukban ismert módszerekkel hajtjuk végre. Általában a fermentlét szűrjük, centrifugáljuk vagy egyéb módon derítjük, majd a proteáz koncentrátumot kicsapjuk, például vízben oldódó szervetlen só, mint nátrium- vagy ammóniumszulfát hozzáadásával, vagy vízzel elegyedő szerves oldószer, mint etanol vagy aceton adagolásával. A csapadékot önmagában ismert módon, például szűréssel vagy centrifugálással különítjük el. A nedves, kicsapott proteázt önmagában ismert módon, például vákuumban száríthatjuk. Különösen előnyös, nagy léptékű szárító eljárást ismertet az 1 360 969. sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás. Ez az ismert eljárás porlasztásos szárítást és azt követően fluidizált ágyban történő szárítást tartalmaz. A megszárított enzim koncentrátumot önmagában ismert módon alakíthatjuk meghatározott aktivitású, kevéssé porzó, kereskedelmi proteáz készítménnyé. Ilyen módszert ismertet az 1 338 249. sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás, amely szerint gyakorlatilag gömb alakú gyöngyöket állítanak elő a proteáz koncentrátum és vízben diszpergálható, szilárd, viaszos kötőanyag, például nemionos detergens keverékéből. Az 1 362 365. sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás eljárása szerint az enzim koncentrátum és valamely szilárd hígítószer, például nátriumklorid megnedvesített premixét, kívánt esetben kötőanyag, például dextrin . és/vagy polietiléngiikol jelenlétében extrudálják, majd gömb alakú részecskékké alakítjuk például a M.rumerizer(R) elnevezésű készülék segítségével, végül a részecskéket fluidizált ágyban szárítják. Úgy is eljárhatunk, hogy a 4 106 991. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismerte tett módon készítünk granulált enzim terméket. A végtermék porzásának további csökkentésére kívánt esetben bevonó eljárást is alkalmazhatunk. A szemcsék bevonását rendszerint megolvasztott viasszal, célszerűen polietilénglikollal végezzük, majd a kapott, bevonattal ellátott terméket elporítjuk, segédanyagokkal összekevert, finom eloszlású színezőanyag, például titándioxid jelenlétében. Olyan mutáns Bacillus licheniformis törzsek is a találmány tárgyához tartoznak, amelyeknél blokkolt a C komponens szintézise, ugyanakkor azonban képesek a szubtilizin szintézisére. A találmány szerinti proteáz koncentrátumot tartalmazó mosószer, hatékony mennyiségben tartalmaz a C komponenstől gyakorlatilag mentes, Bacillus licheniformis eredetű proteáz terméket. Az enzimen kívül a mosószer az alábbiakat tartalmazza : a) Legalább egy felületaktív anyagot, amely anionos, nemionos vagy amfoter vagy vízben oldódó szappan lehet. Általában az anionos felületaktív anyagot (például lineáris alkil-aril-szulfonátot) nemionos felületaktív anyaggal (például alkil-fenü-poliglikoléterrel) együtt használjuk, 5-30, illetve 1-5 súly% mennyiségben, a mosószer súlyára számolva. b) Egy vagy több töltőanyagot, amelyeknek célszerűen egyidejű elkülönítő hatása is van, például nátriumtripolifoszfátot, nátriumszilikátot vagy zeolitokat, általában 10-70 súly% mennyiségben, a mosószer súlyára számítva. c) Fehérítőszert, célszerűen valamely peroxi-vegyületet, például nátriumperborátot, legfeljebb 30 súly% mennyiségben, a mosószer súlyára vonatkoztatva. d) Segédanyagokat, például karboxi-metil-cellulózt, optikai fehérítőszereket és illatosító anyagokat. Ha szűk-. séges, a mosószer tartalmazhat pH-beállító szert is, annak’ biztosítására, hogy a mosóközeg pH-értéke 8,0—10,5 ' között legyen. A találmány szerinti szemcsézett proteáz készítményt olyan mennyiségben adjuk a mosószerhez, hogy a proteáz-aktivitás legalább 0,1 Anson egység (a továbbiakban AU), célszerűen 0,5— 2,5 AU per 100 g mosószer legyen. Kívánt esetben a 100% eléréséhez szervetlen töltőanyagot, célszerűen nátriumszulfátot használhatunk. A folyékony mosószereket enzim szuszpenziókból állíthatjuk elő, célszerűen nemvizes közegben. Az ilyenfajta szuszpenziók általában cseppfolyós nemionos felületaktív anyagban, például TergitoÚR) 15 S9-ben vagy a felületaktív anyagok elegyében eloszlatott, finomra őrölt pioteáz koncentrátumból állnak. A szuszpenzió rendszerint egy vagy több szervetlen töltőanyagot, például finomra őrölt nátriumkloridot is tartalmaz, kívánt esetben szuszpenzió-stabilizátorral, például szilíciumdioxiddal (AerosifiR) 200) együtt. A találmány szerinti proteáz koncentrátumot tartalmazó szuszpenziót olyan mennyiségben adjuk a mosószerhez, hogy a proteáz aktivitása legalább 0,1 AU, célszerűen 0,5—2,5 AU per 100 g folyékony mosószer legyen. A mosószereket önmagában ismert módon, például a komponensek összekeverésével készíthetjük el. Úgy is eljárhatunk, hogy premixet készítünk, amelyhez azután hozzákeverjük a többi alkotórészt. A találmány szerint általában nem alkalmazunk tisztított szubtilizint, például olyan minőségben, amilyen az 1. ábrán látható kromatogram B maximumának megfelelő frakciókból kinyerhető, és amelynek a proteolitikus aktivitása 3—5-szöröse a proteáz koncentráturnénak. Az ilyen rendkívül nagy aktivitású proteáz koncentrátum kezelése elkerülhetetlenül megnövelné annak kockázatát, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
