182981. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz koncentrátum előállítására mosóporhoz
182 981 2 hogy helyi irritációk lépnek fel a legutaköan és a nyálkahártyáknál. Ennek veszélye olyan mértékű lenne, ami már elfogadhatatlan az enzimgyártó üzemben. E • n túlmenően, az ilyen nagy tisztaságú szubtilizin komponens már eléggé instabil ahhoz, hogy használható jegyen a proteáz koncentrátum mint mosószer-enzim. A tisztított enzim és a kereskedelmi proteázkészítmér.yek stabilitása között tapasztalható jelentős különbség nyilvánvalóan annak a következménye, hogy az utóbbi olyan, a táptalajtól származó, enzimaktivitással nem rendelkező alkotórészeket tartalmaz, amelyek stabilizálják a proteázt. Ezek a stabilizáló komponensek legalább is részben azonosíthatók: kisebb molekulájú peptidek és aminosavak, amelyek főképpen a proteáz önfeltárása foly tán képződnek a fermentáláskor. Ugyanakkor további stabilizáló táptalaj-komponensek is jelen lehelnek, amely komponensek szerkezetét nem ismerjük. Az egyszerűség kedvéért a továbbiakban a „peptid frakció” kifejezést foguk használni ezekre a nem proteolitikus táptalaj-komponensekre. A peptid frakciót az első A maximummal együtt eluáljuk, amikor a proteáz koncentrátumot karboxi-metil-cellulózt tartalmazó ioncserélő oszlopon frakcionáljuk az 1. ábrával kapcsolatban ismertetett módon. A pepiid frakció mennyiségét az alábbi képletből számi íjuk ki; peptid frakció, összes nitrogén, % - fehérje nitrogén, % /o “ Ö%4 ~ ahol a fehérje nitrogén az előírt körülmények között előállított triklórecetsavas csapadék nitrogéntartalma. A találmány szerinti proteázkészítmény előnyös kiviteli alakjánál a proteáz koncentrátum proteolitikus aktivitása 2—20, előnyösen 5—15 AU per g, és a táptalajtól származó peptid frakció mennyisége 2—15 súly%. Elvben úgy állíthatunk elő C komponenstől gyakorlatilag mentes proteázkészítményt, hogy csupán a C komponenst távolítjuk el a proteáz koncentrátumból, például frakcionált kicsapással és/vagy szelektív extrakcióval. Eltekintve azonban attól, hogy üyen módszert eddig még nem dolgoztak ki, egy ilyenfajta módszer alkalmazásánál elkerülhetetlen lenne a szubtilizin kitermelés csökkenése. A fentieken túlmenően, a C komponens eltávolításával kapcsolatos költségek jelentős mértékben hozzájárulnának a proteáz végtermék előállításának költségeihez. Összefoglalva, a C komponens eltávolítása gyakorlatilag nem járható út. Hasonló módon, az előállítási költségek elfogadhatatlan mértékű növekedése akadályozná minden olyan módszer bevezetését, amelynél a C komponenst például karboxi-metil-cellulóz oszlopon végzett kromatografálással távolítanánk el, egyszerűen úgy, hogy megszakítjuk az eluálást röviddel a C maximumnak a megjelenése előtt. A kevésbé allergén hatású proteáz koncentrátum előállításának fenti akadályait leküzdöttük a találmány szerinti eljárás kidolgozásával, és gyakorlatilag kiküszöböljük a C komponens képződését, amennyiben olyan Bacillus licheniformis törzset alkalmazunk, amelynek mutációja lényegében blokkolja a C komponens szintézisét, ugyanakkor azonban megőrzi a törzsnek a szubtilizin komponens szintetizálására irányuló képességét. A Bacillus licheniformis törzs három ilyen mutációjának tenyészetét letétbe helyeztük a Northern Regional Research Center-ben (Peoria, Illinois, Amerikai Egyesült Államok) a következő számokon: NRRL B—11301, NRRLB—11302 és NRRL B-l 1303. A mutációk előállítása A Bacillus licheniformisnak azokat a mutációit, amelyeknél blokkolt a C komponens szintézise, ugyanakkor azonban megmarad a szubtilizin szintetizálására irányuló képesség, a következőképpen állítjuk elő. 2% Trypticase-t, 0,5% élesztőkivonatot, 0,0007% kristályvizes vas(II) kloridot, (FeCl2 *6H2 O), 0,0001% kristályvizes mangán(Il)kloridot (MnCl2 • 4H2 O) és 0,0015% kristály vizes magnéziumszulfátot (MgS04 ■ 7H2 O) tartalmazó, 7,3 pH-értékű táptalajon 30°C-on logaritmusosan növekedő sejteket 5 óra elteltével összegyűjtjük, és 5,7 pH-értékű trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-maleát puffer-oldatban szuszpendáljuk. N-Metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidint adunk hozzá 100 mikrogramm/ml koncentrációig, majd a szuszpenziót 30 percig inkubáljuk 30 °C hőmérsékletű vízfürdőn. E kezelés után a túlélés mértéke 0,1%. A sejteket többször átmossuk a puffer-oldattal, majd a fenti táptalajjal készült agar-agar lemezekre helyezzük. A mutáns törzsek kiválasztása Két napig 37 °C-on végzett inkubálás után a kimetszett agar-agar korongokat — amelyek mindegyike egyegy mutáns tenyészetet hordoz — hatszögű elrendezésben üveglemezre helyezzük, és 1%-os agaróz gélt öntünk a lemezre. Az egyes hatszögek közepén kivágott lyukba helyezzük a C komponensre specifikus antiszérum mintáját. A lemezt 30°C-on 1 napig végzett inkubálás után ellenőrizzük. Kiválasztjuk azokat a mutáns tenyészeteket, amelyeknél nem tapasztalható kiválás, altenyészet készítésével tisztítjuk, és rázólombikokban tenyésztjük. A C komponens további jellemzése Az aminosavak analízise A C komponens megközelítő aminosav-összetételét az alábbiakban adjuk meg. A meghatározásoknál a feltüntetett értékek ±10%-át kitevő szokásos hibaszázalék lép fel. összehasonlításul, zárójelek között megadjuk a szubtilizinre vonatkozó irodalmi értékeket. Lizin: 10 (9); hisztidin: 8 (5); arginin: 11 (4); aszparaginsav: 22 (28); glutaminsav: 15 (12); treonin: 33 (19); szerin: 33 (32); prolin: 13(9); glicín: 37(35); alanin: 17 (41); valin: 16 (31);leucin: 7 (16); izoleucin: 15 (10); fenilalanin: 6(4); tirozin: 21 (13); cisztin 1 (2) : 2 (0); metionin: 3(5); triptofán: nem határoztuk meg (1); ammónia: 27(25). Az aminosavak teljes száma: 269 (273), kivéve a triptofánt. Látható, hogy a C komponens aminosav-összetétele jelentősen eltér a szubtilizinétől. A legfeltűnőbb különbség a két cisztein rész jelenléte a C komponensben, és a cisztein hiánya a szubtilizinben. Bizonyos jelek arra mutatnak, hogy a C komponensben a cisztein részeket diszulfidhíd kapcsolja össze. Rendkívül különös azonban az S -S híd jelenléte a C komponensben, amely a Bacillus eredetű proteázok közé tartozik. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
