182544. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidroxi-alkil-purinok aminoalkanollal és p-acetamido-benzoesavval alkotott komplexei előállítására
182 544 hatására fellépő szaporodását fokozó szerek tulajdonságait tanulmányozva találhatunk olyan szereket, amelyek emberben immunpoteneiátor aktivitással rendelkeznek. Az eljárás azonos azzal, amit J. W. Hadden leírt az Infect. & Immunity 1976. februári számában a 382—387. oldalon és különösen a 382—383. oldalon. 3. A makrofág a fehérvérsejtek egyik változata, amely az immunrendszer egyik fontos része mind a sejten belüli, mind a humorális immunitás szabályozásában. Az alább leírt meghatározási rendszer a vizsgált anyagokat a makrofág funkció potenciátoraiként értékeli. Fitohemagglutinint (PHA) (HA—17) a Burroughs Wellcome cégtől szereztünk be. Makrofág mitogén faktort (MMF) és makrofág aktiváló faktort (MAF) tartalmazó készítményt antigén-stimulált immun nyirokcsomók limfocitáiból (tengerimalac) készítettünk a Hadden és munkatársai által már leírtak szerint [Nature 257, 483—485 (1975). Ennek a készítménynek vákuum-dialízissel és Sephadex G—100 oszlopon végzett kromatografálásával történő részleges tisztításával a 35—70 000 dalton közötti tartományba eső olyan aktív frakciót kaptunk, amely mitogén és aktiváló tulajdonságokkal is rendelkezik. Az aktív frakciót használtuk mind a szaporítási, mind az aktivációs meghatározási módszereknél. Módszerek : Ficoll-hypaque alkalmazásával tisztított humán perifériás vér limfocitákat preparálunk, és a fitohemagglutinin által kiváltott limfocita burjánzást triciált timidin beépülése alapján határozzuk meg a Hadden és munkatársai által leírtak szerint [Cell. Immunoi. 20, 98—103 (1975)]. Az egyes vegyületeket fitohemagglutinin szuboptimális, optimális és szupraoptimális koncentrációinál (0,001; 0,01; 0,1 egység/ml) vizsgáljuk. Paraffinolajjal indukált tengerimalac peritonealis makrofágokat preparálunk, és ezeket inkubáljuk egyrétegű tenyészetként (>98% tisztaságú makrofágok). A limfokin (makrofág mitogén faktor) által kiváltott burjánzást triciált timidinnek a 3- és 5-napos tenyészetbe való beépülésével határozzuk meg a Hadden és munkatársai által leírtak szerint [Nature 257, 483—485 (1975)]. Listeria monocytogenes 5 nap tenyésztés után való elölését szolgáló limfokin (makrofág aktiváló faktor)-indukált makrofág aktiválást makrofág aktiváló faktor jelenlétében vagy anélkül végzünk 6 órán át, amint Hadden és England leírják [Immunpharmacology, 87—100. old. (Plenum Press, 1977)]. A fagocitózist Listeria monocytogenes-sel való 20 perces érintkezés alapján mennyiségileg úgy mérjük, hogy megszámoljuk a baktériumot tartalmazó makrofágokat és a fagocita sejtekre eső baktériumokat Labtek kamrában gram-festett egyrétegű tenyészetben. A baktériumok intracelluláris elölését a baktériumokat tartalmazó sejtek számának és a baktérium/sejt értéknek a kezdeti 20 perces érintkezés után 6 órával való meghatározásával értékeljük. Parallel kísérletek, amelyekben makrofágok lízisét és intracelluláris baktériumok tenyésztését vizsgáljuk, bizonyítják az ilyen 29 rendszerben ilyen módon meghatározott bakteriális aktivitás érvényességét. A vegyületeket a három rendszer mindegyikében logaritmikus koncentráció tartományban három párhuzamos kísérletben adagoljuk mitogén vagy limfokin jelenlétében vagy távollétében. Mindegyik típusú kísérletet legalább háromszor elvégezzük. Előbbi kísérletek a farmakológiai modulációra való válasz párhuzamosságát jelzik a burjánzásos és aktiválásos meghatározásokban. Biológiai aktivitás. Leukémiaellenes aktivitás. (L—1210 növekedés gátlása.) Az L—1210 tumort hordozó egerekből izolált leukémiás sejteket in vitro tenyésztjük, és szaporodásukat a tenyészetben levő sejtek számának időegység alatt történő növekedésével mérhetjük. A vizsgált anyagnak a táptalajba való adagolása gátolhatja a leukémiás sejtek szaporodását, ez jelzi a leukémiaellenes szer hatásosságát. A vizsgált vegyületekre az I50 (az L—1210 növekedését gátló koncentráció) %-ban a következő : 30 Vegyület, NPT-szám Koncentráció (ug/ml) L5392 28 15410 54 15417 47 15418 70 A használt meghatározási rendszer az alábbi. Leukémiás sejt (L—1210) növekedésgátlásának mérése. Ellenőrizzük, hogy a törzstenyészetekben megfelelő-e a sejtek szaporodása. Átoltás után 48—72 órás sejteket használjunk. A kívánt végső koncentráció 50-szeresének megfelelően mérjük ki az anyagokat, és készítsünk sorozathígításokat. A végső táptalajt 500 ml Me Coy 5A táptalajból [In Vitro, 3, 85 (1968)], 15 %borjúembrió szérumból, 5 ml penicillin-sztreptomicin oldatból és 5 ml antibiotikum-antimikotikum oldatból állítjuk össze, és szobahőmérsékleten hagyjuk állni. Steril technikát alkalmazva 0,1 ml hígított vegyület-oldatot adagolunk minden egyes kémcsőbe. Megfelelő mennyiségű sejtet adunk az elkészített táptalajhoz, összekeverés után 0,5 ml mintát kiveszünk belőle, és 9,5 ml sóoldatot tartalmazó fiolába töltjük, és számlálóberendezéssel megszámoltatjuk. A kapott számot megszorozzuk 40-nel, hogy kompenzáljuk a 40-szeres hígítást (0,5 ml 0,5 ml sóoldathoz és az inokulumhoz). Minden egyes csőbe töltsünk 5 ml sejtszuszpenziót, Minden 4 kémcső után felkeverjük a palack tartalmát, hogy egyenletesebb sejteloszlást biztosítsunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
