182530. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpesvírus vakcina előállítására
182530 4 A találmány tárgya új eljárás herpeszvírus-vakcina előállítására. Az eljárással olyan vakcinát állíthatunk elő, amely liofilizálás után egyszerű módon, desztillált vízzel helyreállítható. A 3 783 098 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan herpeszvírus-vakcina elő- 5 állítási eljárás ismertetése található, amely szerint a sejteket sejthez kötött vírussal fertőzik meg, a vírust azután egy stabilizálószer jelenlétében kivonják és liofüizálják. Ekkor vakcinához használható stabil, jól tárolható víruskészítményt kapnak. Liofilizálás után 10 a vakcinát egy stabilizáló oldószer segítségével állítják helyre. Ez a vakcina igen széles körben elterjedt, különösen akkor, amikor baromfiak Marek-féle betegsége elleni védelemre kezdték felhasználni. A vakcina előállítását azonban megnehezíti az a 1 körülmény, hogy a liofilizált készítmény helyreállításához stabilizáló oldószerre van szükség. Kidolgoztunk egy eljárást, amelynek segítségével olyan liofilizált, Marek-féle betegség elleni vakcinát 2Q lehet előállítani, amely tiszta víz hozzáadásával hígítható fel a felhasználási koncentrációra. Mint ismeretes, a Marek-féle betegség elleni vakcinát az eddigiekben SPGA-val keverték össze liofllizálás előtt. Az SPGA egy stabilizálószer, amelyet Bovarnick és munkatársai írtak le. (J. Bact. 59:509—522, 1950.) Ez egy olyan oldat, amely literenként 0,218 mól (74,62 g) szacharózt, 0,00376 mól (0,52 g) kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,0071 mól (1,25 g) dikálium-hidrogén-foszfátot, 0,0049 mól (0,912 g) kálium- 3Q -glutamátot és 1% (10 g) szérum-albumint tartalmaz. Az SPGA komponensei azonban nem kizárólag a fenti mennyiségben használatosak. Ismeretes olyan SPGA készítmény is, amelyben a komponensek aránya az előbbiektől eltér, sőt olyan is, amely kálium- 35 -glutamát helyeit nátrium-glutamátot tartalmaz. Valamennyi ilyen készítményt SPGA-nak neveznek, így pl. a 3 783 098 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 6. hasábjának 5-11. sorában olyan SPGA stabilizátorról _ olvashatunk, amely 4Q monokálium-glutamát helyett mononátrium-glutamátot tartalmaz. A 4 002 256 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett SPGA 1 liter steril desztillált vízben 74,62 g szacharózt, 0,45 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 1,35 g dikálium- 45 -hidrogén-foszfátot, 0,956 g mononátrium-L-glutamátot és 40 ml 25%-os albuminoszol (humán albumin) oldatot tartalmaz. Általánosságban azt mondhatjuk, hogy az SPGA stabilizátor mintegy 2—10% cukrot, pL szacharózt, mintegy 0,05-3% egy- vagy két- 50 bázisú alkálifém-foszfátot vagy ilyenekből álló keveréket, pl. kálium-dihidrogén-, dikálium-hidrogén-, nátrium-dihidrogén- vagy dinátrium-hidrogén-foszfátot, mintegy 0,05—0,2% glutaminsavas alkálifémsót, pl. nátrium- vagy kálium-glutamátot és mintegy 55 0,5—2% szérumalbumint, így pl. szarvasmarha szérumalbumint vagy humán albumint tartalmaz. Az SPGA stabilizátor készítése során egyik vagy másik komponenst más vegyülettel is lehet helyettesíteni, így pl. a 3 783 098 számú amerikai egyesült álla- 50 mokbeli szabadalmi leírás 3. hasábjának 59—61. sora szerint a szacharózt részben vagy teljes egészében helyettesíteni lehet valamilyen keményítő-hidrolizátummal, pl. glükózzal vagy dextránnal. A 3 783 098 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi le- 65 3 írás 3. hasábjának 8. sora és a 3 915 794 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint az albumin részben vagy teljesen helyettesíthető kazeinnel vagy polivinilpirrolidonnal. A találmány szerinti eljáráshoz használhatunk bármilyen összetételű SPGA-t, amelynek összetétele az említett körbe esik, de olyat is, amelyben egyes összetevők más, egyenértékű anyagokkal vannak helyettesítve. Ha az SPGA oldatot felhígítjuk a Marek-féle betegség elleni oltóanyag készítéséhez szükséges koncentrációra, vagyis 500 vagy 1000 dózis készítéséhez szükséges térfogatra hígítjuk, akkor olyan oldatot kapunk, amelynek pH-ja 5,0—5,7. A találmány szerint oly módon járunk el, hogy a herpeszvírus-vakcinához a liofilizálás előtt SPGA stabilizátort adunk, valamint egy olyan puffer-rendszert, amely lehetővé teszi, hogy a helyreállított liofilizált vakcina pH-ja a felhasználási koncentrációra való felhígítás után 6,8 és 7,2 között legyen. Ha ilyen puffer-rendszer jelenlétében végezzük a liofilizálást, akkor a liofilizált vírusból vízzel stabil, életképes vakcinát készíthetünk. Puffer-rendszerként előnyösen kálium-dihidrogén- és dikálium-hidrogén-foszfát keverékét használjuk olyan mennyiségben, amennyi elegendő ahhoz, hogy a helyreállítás után kapott oldat kálium-dihidrogén-foszfátra nézve mintegy 0,12 mmólos dikálium-hidrogén-foszfátra nézve pedig mintegy 0,88 mmólos legyen. A Marek-féle betegség elleni oltóanyag készítéséhez pulykaherpeszvírust használunk. Ilyen pl. az FC—126 törzs (ATCC VR 584), amely védelmet nyújt a Marek-féle betegséggel szemben, amint ez az alábbi szakirodalmi forrásból ismeretes: Calnek és munkatársai, Appl. Microbiol. 20:723—726 (1970). A vírust olyan koncentrációban alkalmazzuk, hogy minden egyes mintegy 0,2 ml térfogatú dózis legalább 1000 plakk-képző egységet tartalmazzon. Megjegyezzük, hogy nemcsak a példáinkban bemutatott törzs, hanem bármelyik pulykaherpesz-vírus törzs használható a találmány szerinti eljárásban Marek-féle betegség elleni, vízzel helyreállítható vakcina előállítására. A termékként kapott vírus-szuszpenziót ampullákba töltjük liofilizálás végett. Az egyes ampullákba betöltendő vírusmennyiséget és ezzel összefüggésben az 1 ampullából készíthető oltóanyag-dózisok számát kísérletileg határozzuk meg. Minthogy az egyes dózisok térfogata mintegy 0,2 ml, a helyreállításhoz szükséges térfogatot úgy határozzuk meg, hogy a dózisok számát ampullánként 0,2 ml-rel szorozzuk meg. Minthogy az ampullák rendszerint 500 vagy 1000 oltóanyag-dózist tartalmaznak, az ampullákhoz 100 ml, illetve 200 ml vizet adunk. A találmányt az alábbi példákkal vüágítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa Pulykaherpesz vírus-vakcinát készítünk az ATTC VR 584 törzzsel oly módon, hogy azt 10 hengerpohárban, csirke embrió-fibroblaszton tenyésztjük négy napig 38,5 °C hőmérsékleten 5% steril boíjú-3
