182500. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén interferon előállítására
3 182500 4 Találmányunk tárgya új és javított eljárás homogén interferon előállítására. A fehérjék tisztítása régóta probléma a peptidkémiában. E célhoz alkalmazott megoldások körébe tartoznak kicsapásos eljárások, gélszûrés, iöncserén alapuló kromatográfia, gál-elektroforézis, affinitáson alapuló kromatográfia és sok egyéb módszer. A biológiai anyagokban szélsőségesen alacsony koncentrációban a természetben előforduló nagymolekulájú fehérjék elkülönítésére szolgáló eljárások a felsorolt módszerek sokaságát foglalják magukban. Tekintettel az egész folyamat során bekövetkező nagy veszteségekre, gyakran igen nagymennyiségű nyersanyaggal kell dolgozni. Ebből következik, hogy az ilyen fehérjék tisztítására irányuló eljárások rendkívül bonyolultak és költségesek. Jó példa erre az interferon elkülönítésével, azonosításával kapcsolatos sok különböző kísérlet. Az 1957-ben Isaacs és Lindemann által felfedezett — mind a leukocitákból származó, mind a fibroblasztokból származó — interferonnal kapcsolatban két évtizede világszerte folyó kutatások — amelyek célja a fajlagos biológiai és kémiai tulajdonságainak meghatározására elegendő menynyiségű, homogén peptidkénti elkülönítése volt —■ nem hoztak megfelelő eredményt. A fenti szerzőknek az interferonnal kapcsolatos első munkáit magába foglaló 3 699 222 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint az aktív anyag tisztítása csupán ammóniumszulfáttal történő kicsapásból és ezt követő dialízisből áll. Az ilyen eljárás viszonylag nem specifikus volta miatt a kapott termék még nagy mértékben szennyezett. Az interferon tisztítására többlépcsős eljárást a 3 414 651 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás ismertet. Az eljárás lépései az alábbiak: szelektív adszorpció amorf alumíniumszilikáton, jód- vagy tiocianát-oldattal végzett eluálás, nem kívánt fehérjék kicsapása vizes sósav- és vizes nátriumhidroxid-oldattal, az interferon kicsapása vízzel elegyedő oldószerrel, például metanollal, etanollal vagy acetonnal, végül az újból oldatba vitt interferont valamilyen ioncserélő gyantán, így 2-dietilaminoetil-cellulózon kromatografálják. Ezzel a tisztítási eljárással az interferon aktivitását a 6000-szeresére sikerült növelni. Fajspecifikus interferonokként az idézett szabadalmi leírás a csirke- és a majom-interferont nevezi meg. Egy további tisztítási módszert a 3 975 344 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás ismertet. E szerint humán fibroblasztokból származó, nem tisztított interferon oldatát sűrűségi gradiensen alapuló ultracentrifugálással tisztítják. Ez a módszer — a leírás szerint —■ nagyobb hozamot és tisztaságot eredményez, mint a Sephadex G—100 alkalmazásával végzett oszlopkromatográfiás módszer. Az alábbiakban megadott irodalmi helyek tárgya szintén az interferon tisztítása, megkísérelt azonosítása. Knight, E. : Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 520— 3 (1976); Törmä, E. T. és tsai: J. Biol. Chem. 251 4810—4816 (1976); Bridgen, P. J. és tsai: J. Bioi. Chem. 252, 6585—7 (1977); DeMaeyer-Guignard, J. és tsai: Nature 271, 622—5 (1978); Kawakita, M. és tsai, J. Bioi. Chem. 253, 598—602 (1978) ; Berthold, W. és tsai: J. Bioi. Chem. 253, 5206—11 (1978) ; Jankowski, W. J. és tsai: J. Virology 16, 1124—30 (1975); Davey M. W. és tsai: J. Bioi. Chem. 251, 7620—5 (1976); Chadha, K. C. és tsai: Biochemistry 17, 196—200 (1978). Noha számos publikációban a fent felsoroltak közül azt állítják, hogy egér- vagy humán-interferonokat a teljes homogenitásig sikerült tisztítani, ezt nem igazolják a fehérjék homogenitásának valamilyen klasszikus módszerrel történő kimutatásával, és az állítólag tiszta vegyidetek tulajdonságait sem adják meg. Szakmai körökben általánosan ismert a nagynyomású folyadék-kromatográfia (az alábbiakban az egyszerűség kedvéért : HPLC-módszer) alkalmazása a fehérjék tisztítására. Különösen az ioncserélő kromatográfiát és a kizárásos kromatográfiát írták le (lásd például : Regnier, F. E. és tsai : J. Chromatog. Sei. 14, 316—20 (1976) és Chang, S.—H. és tsai: Anal. Chem. 48, 1839—45 (1976)). A fáziscserés kromatográfiában például oktadecilcsoportokkal módosított szilíciumdioxidből álló oszlopokat (Lichrosorb RP—-18) sikeresen alkalmaztak peptidek, így a ß-endorfin tisztítására (lásd például: Rubinstein, M. és tsai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 4969—72 (1977)). Végül az egerek Ehrlich-féle ascites-tumor-sejtjeiből származó három interferon-fajta (M=33 000, 26 000 és 20 000) részleges azonosítását írták le (Cabrer, B. és tsai, J. Bioi. Chem. 254, 3681—4 (1979) ). Jelen tanulmány tárgya javított, nagyfelbontású, jó hozamú, preparatív mértékű eljárás mintegy 12 000 feletti mólsúlyú fehérjék tisztítására. Az eljárás szerint a szennyezett fehérje vizes oldatát HPLC-feltételek mellett puffer-oldattal egyensúlyba hozott, ciánpropil-, ciklohexil-, fenil-, oktil-, oktadecil- vagy gliceril-csoportokkal módosított, porózus Si02-mátrix bázisú oszlopon keresztül engedjük, ahol a fehérje először adszorbeálódik, majd a fehérjét egy vízzel elegyedő oldószerrel előállított, növekvő vagy csökkenő grádienssel eluáljuk úgy, hogy a fehérjét végül az eluátum bizonyos frakcióiban tisztább formában kapjuk. Az oszlopok, amelyeket egymás után és — a pH-érték, valamint a szerves oldószer tekintetében —- különböző feltételek mellett alkalmazunk, lehetőséget nyújtanak a természetes anyagban szélsőségesen alacsony koncentrációjú fehérjék tisztítására a homogenitásig. A jelen találmány az interferon homogenitásig történő tisztítására vonatkozik, mégpedig olyan mennyiségekben, amelyek ezen orvostanilag értékes anyag első ízben történő kémiai azonosítását teszik lehetővé. Az interferon kémiai azonosításának lehetősége figyelemre méltó haladás e vegyülettel kapcsolatban, hiszen ez az előfeltétele a szintéziséhez, történjék ez akár hagyományos peptidszintézissel, akár gén-manipulálás útján alkalmas organizmusok, előnyösen baktériumok segítségével. A találmány szerinti, homogén interferon elő-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
