182500. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén interferon előállítására
5 182500 6 állítására vonatkozó eljárást az jellemzi, hogy 1. vizes interferon-oldatot oktilcsoportokkal módosított szilíciumdioxid-mátrix-alapú, acetátpufferrel (pH=7,5) pufferolt oszlopon gyors folyadék-kromatografálásnak vetünk alá, és acetát-puffer és kis szénatomszámú alkohol — előnyösen n-propanol — 0%-tól lineárisan emelkedő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk ; 2. az előző lépésnél kapott interferon-tartalmú frakciókat gliceril-csoportokkal módosított szilíciumdioxid-mátrix-alapú, acetát-pufferrel (pH=7,5) pufferolt oszlopon gyors folyadékkromatografálásnak vetjük alá, és acetát-puffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — lineárisan csökkenő alkanolkoncentráció grádiensű elegyével eluáljuk ; majd 3. az interferon-tartalmú frakciókat oktil-csoportokkal módosított szilíciumdioxid-mátrix-alapú, piridin-hangyasav pufferrel (pH=4) pufferolt oszlopon gyors folyadék-kromatografálásnak vetjük alá, és piridin-hangyasav puffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — lineárisan emelkedő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk. Oktil- vagy gliceril-csoportokkal módosított, porózus Si02-mátrix bázisú (a részecskék mérete : 10 g, az átlagos pórusméret : 100 Â) HPLC-oszlopok a kereskedelemben kaphatók, például az EM Laboratories of Elmsford, N. Y., USA, által előállított Lichrosorb RP—8 és Lichrosorb-diol elnevezésű termékek. Oktil-csoportokkal módosított porózus Si02-oszlopokat az E. S. Industries, Marlton, N. Y., USA, Chromegabond C—8 elnevezéssel hoz forgalomba. A fent megadott oszlopokhoz alkalmas HPLC- rendszert a 4 116 046 sz. Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás ismertet. A találmány szerinti eljárás foganatosításakor a szennyezett nagymolekulájú peptid oldatát előnyösen vizes puffer-oldat jelenlétében a szóban forgó fehérje szempontjából alkalmas pH-érték mellett az oszlopon átengedjük. Ezt általában nyomással, előnyösen 3,4 és 340 at közötti nyomással végezzük. Az oszlop anyagán adszorbeálódott fehérjét utána lépésenként, vízzel elegyedő oldószerből előállított gradienssel eluáljuk. Alkalmas oldószerek például az alkanolok, így n-propanol, 2-propanol, etanol, metanol, terc-butanol, továbbá ciklikus éterek, mint amilyen a dioxán. Az eluátumot önmagában ismert módon frakcionálj uk, amikoris az egyes frakciók aktív fehérje tartalmát nagyon érzékeny indikátorok segítségével határozzuk meg. Egy erre a célra alkalmas rendszert például Bohlen és társai, (Anal. Biochem. 67, 438 (1975) ír le. Tanácsos a cél-fehérje jelenlétét biológiai kimutatásra alkalmas módszerrel ellenőrizni. A tisztítandó fehérje jellegétől függ, hogy a két oszlop-típus (a normál elosztásos kromatográfiához és a fáziscserés kromatográfiához alkalmas oszlopok) közül melyiket válasszuk, és milyen sorrendben alkalmazzuk az oszlopokat. Azt találtuk, hogy például humán leukocitákból származó interferon esetében a legjobb eredményeket akkor érjük el, ha a szennyezett interferon-oldatot először oktilcsoportokkal módosított Si02-mátríx bázisú oszlopon (fáziscserés kromatográfia) átengedjük mintegy 7,5 pH-jú puffer-oldat, előnyösen 1 mólos nátriumacetát-ecetsav puffer alkalmazásával, majd növekvő n-propanol-gradienssel eluálunk, utána a gyűjtött aktív frakciókat 0,1 mólos nátriumacetátpuffer alkalmazásával gliceril-csoportokkal módosított Si02-mátrix bázisú oszlopon keresztül engedjük, és az aktív anyagot csökkenő n-propanolgradienssel eluáljuk, végül az elkülönített interferon-komponenseket mintegy 4,0 pH-jú pufferoldat (előnyösen 1 mól piridin és 2 mól hangyasav elegye) alkalmazásával oktil-csoportokkal módosított Si02-mátrix bázisú oszlopokra visszük és növekvő n-propanol-gradienssel eluáljuk. Ilyen módon a három elkülönített humán leukocita interferon (a, ß y) külön-külön bontható tovább, amikoris a kromatogramban élesen egymástól elkülönülő csúcsok jelennek meg ; ezek a homogén fehérjék. Az egész tisztítási eljárással, az inkubáció során nyert folyadéktól a második oktil-módosított oszlopon végzett kromatográfiai lépésig, a tisztaság a 60 000—80 000-szeresére növekszik. A humán leukocitákból származó interferon tisztítására alkalmas foganatosítási mód szerint a 2. lépésben kapott és a csúcskoncentrációkat tartalmazó frakciókat egyesítjük, az n-propanol eltávolítása céljából n-hexánnal extraháljuk és a 3. lépés foganatosítása előtt az n-hexán nyomaitól megtisztítjuk. A humán leukocitákból a találmány szerinti eljárással előállított interferon-fajtákra jellemző a felsorolt HPCL-oszlopokon megjelenő éles csúcs; továbbá a poliakrilamid-gélen nátriumdodecilszulfáttal (NaDodS04) 2-merkaptoetanol jelenlétében végzett gél-elektroforézis során egyetlenegy' keskeny sávot mutatnak. A gélt extrahálva egyetlenegy' éles, vírus elleni aktivitású csúcsot kaptunk, amely azonos volt a fehérje sávval. A tiszta interferonfajták specifikus aktivitása MDBK-sejtek (szarvasmarha epitéliás vesesejtjei) esetén 2,6—4,0xl08 egység/mg, az Ag 1732 sz. humán sejtsor esetében 1,5—4xl08 egység/mg. A molekulasúly mintegy 16 000 és 21 000 között van (lásd: 4. táblázat). Az aminosav-elemzés eredményeit az 5. táblázatban adjuk meg. Az interferonoknak vírus elleni, tumor elleni, növekedésgátló és immun-szuppresszív tulajdonságai vannak. Ezek az aktivitások klinikailag kimutathatók voltak még viszonylag szennyezett, 1 “Zónái kevesebb interferont tartalmazó készítmények napi 1—10' 106 egység dózisban történő beadása esetén is. A találmány szerint tisztított, homogén interferon-készítmények az ismert interferon-készítményekhez hasonlóan alkalmazhatók, a dózis az elért tisztasági foknak megfelelően módosul. Az interferon-fajták önmagukban vagy egymással keverve adagolhatok, továbbá oly'an készítmények formájában, amelyet a tisztítási eljárás megszakításával nyerünk, és amely több interferon-fajtát, de interferon-inaktív fehérjét már nem tartalmaz. A találmány szerinti tisztítási eljárás — bár itt csak a humán leukocitákból származó interferonok példájával ismertetjük — alkalmas egyéb interferonok, például humán fibroblasztokból származó 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
