182464. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tiroxin-kötésindex meghatározására szérumban
5 182464 6 funkciós térhálósító szerekkel, így glutáraldehiddel és hasonlókkal. Ezek a módszerek a szakemberek előtt ismeretesek. A találmány keretein belül előnyösen olyan edényeket, így reagenscsövecskéket alkalmazunk, ame- 5 lyeknek belső fala az antitesttel van bevonva. Az edények alkalmas anyagaira tipikus példák a következők: polisztirol, sztirol-akrilnitril kopolimerizátum, valamint más műanyagok és üveg. A sztirolbázisú műanyagok esetén kielégítő bevonás 10 céljából néha elegendő, ha az antitest oldatát egy ideig az edényben hagyjuk állni. A fenti kivitelezési módszerek analóg módon olyan hordozó anyagokra is használhatók, amelyek nem edények, hanem olyan apró részecskékből áll- 15 nak, amelyek oszloptöltésre megfelelők. Anti-T4-antitesteket a hormonokkal szembeni antitestek készítésére szokásos módszerekkel nyerjük. Előnyös T4 valamilyen alkalmas hordozóproteinnel való konjugátumát használjuk immuno- 20 génként. Különösen alkalmasnak bizonyult a szakemberek által használt nagyszámú hordozó protein közül a marha-szérumalbumin (RSA). A hordozó proteineket kémiailag kapcsoljuk a T4-gyel, például glutárdialdehiddel enyhén lúgos közegben és 25 ezt követő nátrium-borohidrides redukcióval. Egy másik alkalmas kapcsolási módszer a morfolino-diciklohexil-karbodiimiddel történő reagáltatás. Az így kapott T4-immunogén alkalmazásához megfelelő kísérleti állat például nyúl vagy birka. Al- 30 kalmasak azonban más állatfajok is. A találmány szerinti előnyös, peroxidázzal jelzett T4 előállítását célszerűen (terc-butoxi-karbonil)-tiroxin-(N-hidroxi-szukcinimid)-észter peroxidázzal történő reagáltatásával, és a kapott 35 termék kromatográfiás tisztításával végezzük. Hasonló módon a számításba vehető legtöbb egyéb enzim is kapcsolható más ismert peptidkémiai eljárás alkalmazásával. Amint említettük, a találmány szerinti eljárás so- 40 rán meghatározott mennyiségű T4-et reagáltatunk. Ügy találtuk, hogy ez a mennyiség célszerűen 100—500 ng T4/ml szérum. Használható azonban kisebb vagy nagyobb mennyiség is. A fent említett mennyiségi tartomány azonban gyakorlatilag min- 45 den előforduló szérumösszetételhez megfelelő, és alkalmas mind hipertiroidális mind hipotirodális szérumokhoz. A hozzáadandó enzim-jelzett T4 mennyisége függ a mindenkori alkalmazott enzim fajtájától, különösen az enzim fajlagos aktivitása- 50 tói, amely még könnyen meghatározható. A peroxidázzal való előnyös jelölés esetében célszerűen olyan mennyiséget alkalmazunk, hogy a tulajdonképpeni tesztkeverékben körülbelül 1—200 mü perodidáz/ml legyen. 55 A szérumból, pufferból, T4-ből és enzim-jelzett T4-ből álló reakcióelegyet az oldhatatlan, különösen hordozóra kötött anti-T4-antitesttel elegendő hoszszú ideig hagyjuk érintkezni, hogy elérjük a jelzett T4 és antitest állandó kötési arányát. Az idő- 60 tartam bizonyos mértékben függ a körülmények-, tői, pH-tól, hőmérséklettől és koncentrációtól Általában körülbelül órától körülbelül 2 óráig terjedő érintkezési idő elegendő. Az inkubáció befejezése után az oldatot elválasztjuk a hordozótól, 65 példáid az edényből való kiöntéssel, a hordozót vízzel lemossuk, és végül elvégezzük a hordozóhoz kötött enzimaktivitás meghatározását. Az előnyös kiviteli forma esetén, amikor edényalakú hordozót és jelző enzimként peroxidázt használunk, például hidrogén-peroxidot és ABTS<-t [2,2’-azino-di/3- etil-benztiazolin-6-szulfonát)-ot] adunk hozzá a pufferoldatban, és 405 nm-nél meghatározzuk az ext inkció-különbséget. A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti eljárás kivitelezésére szolgáló tesztkészlet. Ez lényegében tiroxinból, enzim-jelzett tiroxinból, oldhatatlan szilárd antí-tiroxin-antitestből, pufferanyagból és az enzimaktivitás meghatározására szolgáló reagensből áll. Alkalmas pufferok olyanok, amelyekkel 7,5 és körülbelül 9,3 közötti pH-érték állítható be. Előnyös a 8,0 és 9,0 közötti pH-érték. A megadott tartományban alkalmazható pufferokra tipikus példák a következők : foszfát jraffer, triszpuffer, borax-puffer, barbitalpuffer. Előnyös a 0,05—0,5 mólos barbitalpuffer. A találmány szerinti tesztkészlet ezenkívül — előnyösen — még szokásos stabilizálószereket, így marha-szérumalbuminí, szénhidrátokat, glicerint, valamint immunreakciót elősegítő adalékként poliszacharidokat, polietilénglikolokat tartalmazhat. A találmány szerinti tesztkészlet-enzimjelölt leként tiroxin-peroxidázt tartalmaz. Az enzimaktivitás meghatározására szolgáló reagens ebben az előnyös esetben hidrogén-peroxidból, vagy valamilyen hidrogén-peroxidot szolgáltató vegyületből, így nátrium-perborátból vagy Perhydrítből valamint 2,2’-azino-di(3-etil-benztiázolin-6-szulfonát)ból [amelyet ABTS<-nek neveznek], továbbá valamilyen alkalmas pufferból áll. Alkalmas pufferra tipikus példa a pH 4,5—6,0-os foszfát-citrát-puffer. Ehhez a kiviteli formához alkalmas más reagens 7,0 pH-jú foszfátpuffert, gvajakolt és hidrogén-peroxidot tartalmaz. A találmány szerinti előnyös tesztkészlet egyik speciális kiviteli alakja a következőket tartalmazza: tiroxin tiroxin-peroxidáz barbitalpuffer, pH 8,6 marha-szérumalbumin anti-tiroxin-antitest (hordozó nélkül számítva) hidrogén-peroxid ABTS 100—400 ng/ml, 5—100 mU/ml, 0,1— 0,2 mólos, 0,2%, 1— 0,05 [xg/ml, 0,5— 4,5 mmól/1, 5— 50 mmól/1, foszfát-citrát-puffer, pH 5,0 0,1— 0,2 mólos. Az enzimmel jelzett tiroxin előállításánál előnyösen (terc-butoxi-karbonil)-tiroxin-(N-hidroxiszukcinimid)-észterből indulunk ki, és a reakciót puffer/dimetil-formamid (1:1) elegyben végezzük. Pufferként mindenkor az éppen alkalmazott enzim részére legmegfelelőbb puffert használjuk. A konjugátum tisztítására fenil-butil-amin-Sepharose vált be. A találmány a szérum tiroxin-kötésindexének meghatározására egy egyszerű és szokásos laboratóriumi eszközökkel kivitelezhető eljárást bocsát rendelkezésre, amelynek pontossága megfelel a radioaktív jelzés alkalmazásával végzett ismert 4
