182464. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tiroxin-kötésindex meghatározására szérumban
7 182464 8 módszerének, de nem rendelkezik annak hátrányaival. A következő példák a találmányt részletesebben szemléltetik. 1. példa A) Anti-tiroxin-antitestek (Anti-T4-antitest) előállítása 500 mg marha-szérnmalbumint (Bo^hringer Mannheim GmbH) 6,5 ml kétszer desztillált vízben oldunk, és az oldat pH-értékét 1 mólos nátrium-hidroxid-oldattal 10—11-re állítjuk be. Ehhez az oldathoz 250 mg tiroxint (Merck), majd 0,64 ml, 25%-os glutár-dialdehid-oldatot (Merők) adunk, és 18 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A Schiffbázist szobahőmérsékleten, 8 óra alatt összesen 130 mg nátrium-bór-hidriddel (Merők) redukáljuk. A reakcióoldatot 50 mmólos, 10,5 pH- írt ék íí trisz-pufferral szemben dializáljuk, majd 64 ml Sephadex G 25 töltettel (Pharmacia) rendelkező kromatografáló oszlopra visszük, amely 50 mmólos, 10,5 pH-értékű trisz-pufferral van egyensúlyban. Ugyanezzel a puffernd eluálunk, és az eluátumot 85 ml Dovex 1x2 (Serva) töltetű kromatografáló oszlopon átfolyatjuk, ami az albumin-tiroxin konj ugátot nem, de a szabad tiroxin maradékot visszatartja. Végül 0,1 mólos 10,5 pH-órtékű glieinpufferral szemben dializálunk. Az így kapott terméket Freund-féle adjuvánssal kiegészítve kísérleti állatoknak adjuk be anti-T4-antitestek képzésére. B) T4-peroxidáz (POD—T4) előállítása 100 mg torma-peroxidázt (POD tisztasági fok I, tisztasági szám 3,6, 250 U/mg, Boehringer Mannheim GmbH) 10 ml 0,1 mólos kálium-foszfát-pufferben (pH=8,5) oldunk, és az oldatot 9,4 ml diniét il-formamiddal elegyítjük. Keverés közben 25 mg, 0,6 ml dimetil-formamidban oldott (terc-butoxi-karbonil)-tiroxin-(N-hidroxi-szukcinimid)-észtert adunk hozzá, és 20 órán át jégfürdőben inkubáljuk. A reakciókeveréket ,,A puffer”-ral (40 mmólos trisz—HCl/0,15 mólos XaCl, pH=7,5) szemben dializáljuk, majd 60 ml fcnil-butil-aminfespharózzal töltött kromatografáló oszlopra viszszük, amely az említett „A puffer”-ral van egyensúlyban. 180 ml ,,A puffer”-ral mossuk, majd a POD—T4-konjugátot 50 térfogatszázalék etilénglikolt tartalmazó 1 mólos vizes nátrium-kloridoldattal eluáljuk. A POD—T4 tartalmú eluátumot 4 ml 0,5 mólos hidroxil-amin-hidrokloriddal elegyítjük, és 2 órán át 4 °C-on keverjük. Ezt követően a terméket 40 mmólos 6,5 pH-órtékű foszfát-pufferral szemben dializáljuk. A liofilezés előtt 1 mg POD—T4-hez 5—10 mg marha-szérumalbumint adunk. C) Hordozóhoz kötött anti-T4-antiteatek előállítása Nyulakat T4-ből és edesztinből (kendermagokból előállított protein) álló konj ugatta! immunizálunk. A konjugát edesztin-molekulánként 100 molekula T4-et tartalmaz. Az immunizálási terv szerint a nyulakat az 1., 7., 14. és 30. napon, valamint ezt követően minden 4. héten 40—100 gg edesztin-T4-konjugáttal immunizáljuk intramuszkulárisan. 4 hónap után vért veszünk a fülvénából. 500 ml nyúl-anti-T4-antiszérumot 500 ml desztillált vízzel hígítunk, és 4 °C-on cseppenként 1,33 liter, 3,5 mólos ammónium-szulfát-oldattal (ph= =6,0) elegyítjük. A kicsapott protein-frakciót centrifugáljuk. A csapadékot 100—100 ml, 2,0 mólos ammónium-szulfát-oldatban kétszer szuszpendáljuk, majd ismét centrifugáljuk. Ezután a csapadékot 500 ml, 0,04 mólos, 7,4 pH-értékű foszíát-pufferben oldjuk. Az immunglobulin-frakció oldatát 0,04 mólos, 7,4 pH-értékű foszfát-pufferrai 1:6000 arányban tovább hígítjuk. Az így kapott oldat. 1,5 ml mennyiségét éjszakán át sztirol-akrilnitril kopolimerből (Luran) készült kémcsőben (méretek: külső átmérő 10,5 mm, magasság 40 mm) állni hagyjuk. A kémcsövek tartalmát kiszívatjuk, 1% marha-szérumalbumint tartalmazó fiziológiás konyhasóoldattal mossuk, majd szárítjuk. D) A meghatározás kivitelezése. A C. pont szerint anti-Tj-antitestíel bevont kémcsőbe 10 gl szérumot pipettázunk, és ezt követően 1 ml olyan reagenst, amely 280 ng/ml T4-et és 10 mU/ml T4-peroxidázt tartalmaz 0,12 mólos 8,6 pH-jú barbitalpufferban és 0,2% marha-szérumídbumint. Utána 2 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a csöveket szívatással kiürítjük, és beletöltjük a peroxidáz-reagmst. Az utóbbi 1,47 mmól/1 hidrogén-peroxidot és 14 nimől/1 ABTS-t tartalmaz 5,0 pH-jú 0,2 mólos foszfát-cit- i át pufferban. A fellépő elszíneződést 405 nm-nél mérjük. Kiértékelés céljából két különböző T4-kötőkapa< itású standarddal — amelyeket a mintákhoz hasonlóan kezelünk — kalibrációs egyenest veszünk fel, amennyiben az ezekre a standardokra mért extinkciók reeiprokértékeit tüntetjük fel vagy a standardok által megkötött T4-mennyiségek, vagy közvetlenül az ezekre a standardokra előzőleg megadott TBI-értékek függvényében. E) A módszer alkalmazása humán-szérumok vizsgálatára. 83 humán-szérum-mintát vizsgáltunk meg összehasonlítva a találmány szerinti és egy a kereskedelemben már forgalmazott T3—Jisj-öt. alkalmazó eljárással. Ha a vizsgált szérumokat az illető módszerre érvényes normáltartomány szerint a mindenkor kapott TBI-értékek alapján csökkent, normális és megnövekedett T4-kötőkapacitású osztályokba soroljuk, úgy azt látjuk, hogy a két módszer között kielégítő egyezés áll fenn. (Lásd 1. táblázat). 1. táblázat A TBI meghatározására szolgáló találmány szerinti eljárás (A) összehasonlítása egy szokásos TBI r > dioimm unok'giai meghatározási módszerrel (B) humán-szérum-minták esetében. (n=83). B A 1 2 3 1 28 í 2 1 28 3 3 22 1. csökkent 1 2. normális > T4-kötőkapacitás. 3. megnövekedett J 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
