182464. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tiroxin-kötésindex meghatározására szérumban
3 182464 4 A pajzsmirigy-diagnosztika különös jelentőséggel rendelkezik a klinikai kémia keretein belül a pajzsmirigy vizsga latok széles körű elterjedése miatt. A bázis-in-vitro pajzsmirigy-diagnosztika felöleli a szérumban jelenlévő összes tiroxin (ossz—T4) meghatározását valamint a tiroxin-kötő globulin (TBG) koncentrációjának a meghatározását, amely az úgynevezett trijód-tironin-felvétel (T3-f elvétel), vagy tiroxin-kötésindex-teszt (TBI-teszt) segítségével történik. Az említett T3-felvétel-teszttel a pajzsmirigyhormont hordozó proteinek maradék kötési kapacitását (RBK) határozzák meg szérumban. Ilyen protein például a tiroxin-kötő globulin (TBG), amelyhez az összes jelenlévő T4-mennyiség körülbelül 60%-a kötődik, valamint a tiroxin-kötő prealbumin (TBPA) és albumin. A maradék kötési kapacitás lényegében a pajzsmirigyhormon kötődése a TBG-re. így például magasabb ^-tartalommal járó hipertireózis esetében több, liipotireózis esetében kevesebb kötési helyet foglal el a hordozó proteinen a T4 és T3 pajzsmirigyhormon. A TBI-meghatározás egyik ismert eljárása esetében meghatározott mennyiségű radioaktív T3-at elegyítünk a szérummintával és egy anioncserélővei. A hordozó protein és az anioncserélő szabad kötési helyei versengenek a radioaktív T3-ért. Minél több szabad kötési hely van a hordozó proteineken, annál több radioaktív T3 kötődik meg ott, míg a maradék az ioncserélőre kötődik. A kiértékelés úgy történik, hogy vagy az ioncserélőn vagy az oldatban mérjük a radioaktivitást. Az oldatban mért radioaktivitásnak —- amely annak a radioaktív Tj-mennyiségnek felel meg, amely a vizsgálandó szérum hordozó proteinjeihez kötődött — egy standard minta oldatában mért radioaktivitáshoz való aránya a standardra specifikus faktorral szorozva adja meg az úgynevezett tiroxin-kötésindexet (TBI). Ennek az ismert eljárásnak egyik hátránya az, hogy radioaktív anyagokat kell hozzá felhasználni. Ezáltal egyrészt drága és komplikált mérőberendezések szükségesek, másrészt a radioaktív reagensek kezelését ezen anyagok potenciális egészségkárosító hatása miatt törvényes rendelkezések megnehezítik. A jelen találmánynak ezért az a feladata, hogy olyan eljárást bocsásson rendelkezésre a TBI-meghatározáshoz, amely nem rendelkezik ezekkel a hátrányokkal, és lehetővé teszi, hogy a pajzsmirigydiagnosztika részére a TBI-t egyszerű, minden laboratóriumban meglévő mérőeszközökkel kielégítően meghatározzuk. Ezt a feladatot a tiroxin-kötésindex szérumban való meghatározására szolgáló olyan eljárással oldottuk meg, amelyre az jellemző, hogy a vizsgálandó szérummintát meghatározott mennyiségű tiroxinnal és meghatározott mennyiségű, kovalensen a tiroxinhoz kötött, meghatározható enzimmel elegyítjük, a kapott oldatot szilárd fázisban lévő antitiroxin-antitestekkel hozzuk érintkezésbe, a folyékony és a szilárd fázist elválasztjuk, és mérjük a hozzáadott meghatározható enzim aktivitását a fázisok egyikében. A találmány abból a meggondolásból indul ki, hogy a kitűzött feladatot megoldhatná, ha az ismert T3-felvétel-tesztnél a radioaktív jelzést enzimjelzéssel helyettesítenék, jelzőként valamilyen könnyen meghatározható enzimet alkalmazva. Az elvégzett kísérletek azonban azt mutatták, hogy az ismert T3-felvétel-tesztnél a radioaktív jelzett T3-t (T3—J125) nem lehet enzimmel jelzett T3-mal vagy Trgyel (amelyet szívesebben használnának) helyettesíteni. Az derült ki, hogy az enzimmel jelzett T3-t vagy T4-t a szérumproteinek kötőképes helyei nem kötik meg. Feltehető, hogy ez a nagy térigényű enzimmaradékra vezethető vissza, amely a kötést sztérikusan gátolja. Meglepően azonban azt állapítottuk meg, hogy az enzimmel jelzett T4 versenghet az enzimmel nem jelzett T4-gyel anti-T4-antitestekért, amelyek szilárd fázisban vannak. A találmány szerinti eljárásnál egyrészt a szérumproteinek kötőképes helyei és az oldhatatlan anti-T4-antitestek versengenek a T4-ért, mikoris minél több T4 kötődik az anti-T4- -antitesteken, annál kevesebb a szabad kötőhely a szérumban. Másrészt egyidejűleg az anti-T4-antitestekért verseng az enzimmel jelzett T4 az enzimmel nem jelzett T4-gyel. Annál több enzimmel jelzett T4 kötődik a szilárd fázisra, minél nagyobb a szérum tiroxin-kötő kapacitása és így a tiroxinkötésindex (TBI) is. A szilárd fázisban mért enzímaktivitás ezért közvetlen mértékét adja a TBI nagyságának. Mérhető azonban az aktivitás a folyékony fázisban is. Jelző enzimként a találmány szerinti eljárás keretein belül használható minden egyes minden további nélkül meghatározható enzim, amely enzimaktivitásának csökkenése nélkül kapcsolható tiroxinra. A találmány keretein belül előnyösen olyan jelző enzimeket használunk, amelyeknek az aktivitása könnyen meghatározható valamilyen optikai vizsgálattal, különösen látható fényben észlelhető színreakcióval vagy a NADH-koncentráció változásával. Alkalmas jelzőenzimekre tipikus példák a következők: peroxidáz, glükózoxidáz, a- és 3-galaktozidáz, glükoamiláz, invertáz és lúgos foszfatáz. Valamennyi fent megnevezett enzimre ismeretesek egyszerű és gyors meghatározási módszerek. [Lásd H. U. Bergmeyer: „Methoden der enzymatischen Analyse”, Verlag Chemie, 3. kiadás, 1974.] A szilárd fázisban jelenlévő anti-T4-antitest hordozómentes is lehet, például polifunkciós reagensekkel, így dialdehidekkel, dioxidokkal és hasonlókkal térhálósítva, és így oldhatatlanná téve. Az antitestet azonban előnyösen valamilyen szilárd hordozóhoz kapcsoljuk. Az anti-T4-antitestek szilárd hordozója lehet minden, a vizsgálat során használt anyaggal szemben iners anyag, amelyhez az említett antitest kapcsolható. Azt találtuk, hogy az anti-T4-antitest számos anyag esetében adszorpciós erőkkel kielégítő szilárdsággal kötődhet a hordozó felületéhez. Lehetséges azonban az is, hogy az antitestet a biológiailag aktív proteinek szilárd hordozókon való rögzítésére szokásos módszerekkel, például kovalens kötésekkel, rögzítsük. Tipikus példa erre a hordozó felületének bróm-ciános módszerrel történő aktiválása, protein-kopolimerizáció, az antitest felületi térhálósítása a hordozón poli-5 10 l;i 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
