182458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás in vivo fibrinolitikus hatású enzimszármazékok előállítására
19 182458 20 ti pufferoldaítal készített 0,2 mólos oldatával elegyítjük és 4 °C hőmérsékleten 10 percig inkubáltatjak. Ezután az elegyet leszűrjük, a szűrőn maradt anyagot a fenti s-amino-kapronsav-oldat újabb 55 ml-jével mossuk, majd a szűrletet kétszer váltott 50 millimólos arnmónium-hidrogén-karbonát puffer - oldattal (pH — 7,0) szemben dializáljuk (5 liter pufferoldatot alkalmazunk erre a célra); a dialízist 4 °C hőmérsékleten 2 óra hosszat folytatjuk. A végül is visszatartott dializátumot T 70 dextránnal (a Pharmacia vállalat terméke) elegyítjük, majd fagyasztva szárítjuk. Ily módon 1,98 g fehér szilárd terméket kapunk. Ezt az inaktivált anyagot kvantitatívan reaktiválhatjuk oly módon, hogy az a plazmint körülbelül 2 óra alatt szabadítsa fel a dezacilálás fentebb megadott reakciókörülményei között. Az L, 2. és 4—-18. példában leírt acilezőszereket humán plazminnal reagáltatjuk a fenti 19. példában leírt módszerrel és így a megfelelő blokkolt plazminokhoz jutunk. A 10. példában leírt acilezőszer esetében célszerű az acilezőszert nagyobb koncentrációban alkalmazni vagy a reakciót hosszabb ideig folytatni, hogy a reakció teljes végbe menetelét biztosítsuk. Az utóbb említett vegyületek dezacilezési reakciósebességét a példák végén közölt T. táblázatban adjuk meg. 20. példa Liofilizált humán p-guanidino-benzoil-plazmin 8,45 nanomól humán plazmint 1,0 ml 20 tf./tf. %os glicerin-oldatban 10—10 mikroliter 0,1 mólos dinétil-szulfoxidos p-guanidino-benzoesav-p’-nitro-fenilészter-oldattal kétszer kezelünk 10 percig 0 °C hőmérsékleten. Az oldatot azután híg sósavval 6,0 pH-értékra állítjuk ba és 2 liter 10 millimólos ammónium-hidrogénkarbonát-pufferoldattal (pH—■ 7,0) szemben 2 óra hosszat dializáljuk. A termékhez 100 mg L-lizin-hidrokloridot adunk és az elegyet liofilizáljuk. A kapott 93,5 mg halványsárga szilárd terméket elkülönítjük; ez a termék hidrolízis útján aktivizálható plazmin felszabadítására. 21. példa Transz-cinnamoil-sertésplazmin-oldat készítése 1,73 mikromól sertésplazmint 26 ml 0,9 súly/tf-%. os nátriirm-klorid-oldattal készített 10 tf./tf.%-os glicerin-oldatban 3,02 mg transz-fahéj sav-p-amidino-fenilészter 1 ml 0,9 súly/tf.%-os nátrium-kloridoldattal készített szuszpenziójával 20 percig keverünk 4 °C hőmérsékleten. Az elegyet azután —20 °C hőmérsékleten megfagyasztjuk és éjjelen át ezen a hőmérsékleten tartjuk. Felengedés után az elegyet 2 liter fenti glicerin-sóoldat elegyben 4 °C hőmérsékleten 2 óra hosszat dializáljuk. Az így kapott terméket felhasználásig 0 °C hőmérsékleten tároljuk. A fent leírt módon kapott termék az eredeti enzim aktivitásának legfeljebb 0,5%-át elérő aktivitást mutatott, 2 óra alatt azonban reaktiválható volt a fentebb leírt dezacilezési reakciókörülmények között. 22. példa p-Anizoil-sztreptokináz és humán plazminogénaktivátor komplexének az előállítása 5-104 egység sztreptokináz (az A.B. Kabi cég, Stockholm, Svédország gyártmánya) 10,5 ml 0,9 súly/tf.%-os nátrium-klorid-oldattal készített oldatát 0,025 ml (4,9 nanomól) Lys-humán plazninogénnel elegyítjük. Az elegyet 25 °C hőmérsékleten 40 percig inkubáltatjuk, majd 2,0 ml 0,9 súly/ if.%-os nátrium-klorid-oldattal készített 20 tf./tf.% os glicerin-oldatban oldott 0,1 mólos trisz-hidroxinetilamino-metán-hidroklorid-cldattal (pH = 7,4) hígítjuk. Az így kapott oldatot 0,1 millimólos p-me- 1 oxi-benzoesav-p’-amidino-fenilészter-oldat (0,1 mólos dimetil-szulfoxidos törzsoldatból készítve) 3 adagjával kezeljük 3—-3 percig 25 °C hőmérsékleten. Az ily módon acilezett enzimet azután 2,5 ml 33 súly/t.f.%-os (nedves súlyra számítva) L-lizinszefaróz-4B szuszpenzióval elegyít jük és az elegyet 0 °C hőmérsékleten 10 percig állni hagyjuk. A kapott szuszpenziót leszívatással leszűrjük és a szűrőn naradt szilárd anyagot a fenti trisz-glicerin-sóoldat puffer 4 °C hőmérsékletre lehűtött 100 ml-jével mossuk. A fenti módon kapott gélt 5 ml fenti trisz-glice- 7'in-sóoldat pufferben, amelyhez még 0,1 mól amino-kapronsavat is adtunk, újból szuszpendáljuk, a gél-szuszpenziót 2 percig 1000 g-nél centrifugáljuk és az így derített, majd elkülönített 4 ml szupematáns-oldatot 2,0 liter 4 °C hőmérsékletre lehűtött fenti trisz-glicerin-sóoldat pufferrel szemben dializáljuk 2 óra hosszat. Az acilezett aktivátor-komplex így kapott oldata a fentebb leírt módon regenerálható; a regenerált komplex 37 °C hőmérsékleten 2,7 -10~4 sec-1 pszeudo-elsőrendű sebességi állandóval szabadítja fel az enzimet. 23. példa 3-Metil-4-metoxi-benzoil-sztreptokináz-humán plazminogén-aktivátor-komplex oldatának előállítása Ezt az anyagot a 22. példában leírttal egyező módon állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy az acilezést 0,2 millimól végső koncentrációjú 3-metil-p-metoxi-benzoesav-p’-amidino-fenilészter 2 adagjával végezzük 25 °C hőmérsékleten lefolytatott 15—15 perces kezeléssel, majd az elegyet 1 óra hosszat tartjuk 0 °C hőmérsékleten. Az így kapott termék regenerálható; a regenerált komplex 1 ■ 10~< sec-1 pszeudo-elsőrendű sebességi állandóval szabadítja fel az enzimet. 24. példa p-Metoxi-benzoil-humán-plazmin és p-metoxi-benzoil-sz treptokináz-humán-plazminogén aktivátor-komplex elegyének előállítása 216 mg (2,56 mikromól) Lys-humán-plazminogént 6,8 mg/ml koncentrációban oldunk egy 7,4 pH- értékű 0,1 mól trisz-hidroximetilainino-metán-hidrokloridot, 0,9 súly/tf.% nátrium-kloridot és 20 tf./tf. % glicerint tartalmazó pufferoldatban, majd ehhez az oldathoz 1,2 • 104 egység sztreptokinázt (körülbelül 2,67 nanomól, az A.B. Kabi svédországi cég gyártmánya) adunk. Az elegyet 25 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat inkubáltatjuk, majd további glicerint adunk hozzá, 33 tf./tf. % glicerin-koncentrációig. Az így kapott 9,0 ml oldathoz acilezés céljából 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
