182458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás in vivo fibrinolitikus hatású enzimszármazékok előállítására
21 182458 22 0,1 millimól végső'koncentrációjú p-metoxi-benzoesav-p’-amidinodenílészter-oldat 2 adagját adjuk 15 perces időközökben 25 °C hőmérsékleten. A kapott reakcióterméket 2 liter fenti pufferoldattal szemben 1 óra hosszat dializáljuk. Az így oldat alakjában kapott termék aktivitása az eredeti plazmin-aktivitás 1%-ánál kisebb volt; a terméket ebben az alakban közvetlenül felhasználhatjuk a nyulakon folytatott kísérletekhez. 25. példa p-Metoxi-benzoesav-(3H-metoxi)-p’-amidino-fenilészter sztöchiometrikus reakciója humán és sertés plazminnal a) Humán plazmin 0,2 ml 2,76 • 10“5 mólos humán plazmin-oldatot (5,34 nanomól) triciummal jelzett p-metoxi-benznesav-p’-amidino-fenilészter (specifikus rádióaktivvitás: 22,8 mCi/ nillimól) 20 millimólos oldatának 2 adagjával reagáltatunk 7,5 perces időközökben, 25 °C hő Mérsékleten. Ezután 1,8 ml 10 súly/tf.%-cs acetonos triklór-ecetsav-oldatot adunk a reakcióelegyhez és a levált fehérjét érmékét 3 percig 1500 gvel történő centrifugálással elkülönítjük. Az elkülönített szilárd terméket a fenti acetonos savoldat 2—2 ml-jével kétszer mossuk, majd 1,0 ml 2 n nátrium-hidroxid-oldatban oldj uk. Az így kapott oldat folyadék-szcintilláció-S2ámlálása azt mutatta, hogy a fehérjéhez kapcsolódó rádióaktivitás átlagértéke0,130 mikro-Ci, ami 5,73nanomól jelzett p-metoxi-benzoesavnak felel meg. b) Sertés plazmin A fent leírthoz hasonló kísérletet végzünk 5,29 -10~5 mólos sertés-plazmin-oldattal (10,54 nanomól) ; az így kapott tennék átlagos rádióaktivitása 9,58 nanomól jelzett p-metoxi-benzoesavnak felel meg. 26. példa Liofilizált p-metoxi-benzoil-sztreptokináz-humán-plazminogén akt ivátor-komplex 9 -104 egység sztreptokinázt 0,9 ml 0,9 súly/tf.%os nátrium-klorid-oldatban 0,075 ml (14,9 nanomól) Lys-humán plazminogénnel elegyítünk. Az elegyet 25 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáltatjuk, majd 4,0 ml 0,1 mólos 7,4 pH-értékü trisz-hidroximetilamino-metán-hidroklorid-pufferoldattal hígítjuk. Az így kapott oldatot 0,1 millimól végső koncentrációjú p-metoxi-benzoesav-p’-amidino-fenilészteroldat (10 millimólos dimetil-szulfoxidos törzsoldatból készítve) 3 adagjával kezeljük, egyenként 5 perc időtartammal, 25 °C hőmérsékleten. A fenti módon acilezett enzimet 5,0 ml 33 súly/tf.%-os (nedves súlyra számítva) L-lizin-szefaróz-4B szuszpenzióval elegyítjük és 0 °C hőmérsékleten 10 percig állni hagyjuk. A kapott szuszpenziót leszívatással leszűrjük és a szűrőn maradt szilárd anyagot 200 ml 4 “Cira lehűtött fenti trisz-hidroklorid-pufferoldattal mossuk. A kapott gélt 5,0 ml 50 millimólos trisz-hidroklorid-pufferoldattal (pH = 7,4) készített 0,1 mólos amino-kapronsav-oldatban szuszpendáljuk, majd leszűrjük és 5—5 ml fenti pufferoldattal háromszor mossuk. Az így kapott eluátumokat egyesítjük és 2 liter mannitos 5 súly/tf-%-os trisz-hidroklorid-pufferoldattal (5,0 millimól, pH = 7,4) szemben 2 óra hosszat dializáljuk 4 °C hőmérsékleten. Az. így kapott dializátumot liofilizáljuk, amikor is 0,560 g fehér poralakú terméket kapunk. Ennek a terméknek az enzimaktivitása kisebb, mint az eredeti enzim aktivitásának 5%-a; a termék vizes közegben 37 °C hőmérsékleten regenerálható. Hidrolizis-adatok : Az 1—18. példában leírt acilezőszerekkel készített enzimszármazékok pszeudo-elsőrendű hidrolízis-sebességi állandóit (K) az alábbi I. táblázatban foglaltuk össze. 1. táblázat Az aktív helyeken szerinnel szubsztituélt plazminok dezacilezósi reakciósebessége pH = 7,4; 37 °C-on Acilcsoport Humán plazmin K sec—1-104 Sertés plazmin K sec—1,104 p-fluor-benzoil-3,30 benzoil-5,20 1,90 p-toluil-2,30 0,74 p-metoxi-benzoil-1,10 0,33 transz-cinnamoil— 4,20 p-metil-transz-cinnainoil— 2,92 3-(2-furil)-akriloil-1,33 1,50 p-guanidino-benzoil-0,41 0,21 N-metil-p-guanidino -benzoil-2,0 — 0-metoxi-benzoil-1,82 — p-acetamido-benzoil-2,70 — acetil-szaliciloil-4,70 — 3,3-dirnetil-akriloil-0,69 — 3,4-dimetil-benzoil-0,55 — 3-metil-4-metoxi-benzoil-0,70 — 0-toluil-1,71 — p-etoxi-benzoil-1,10 — 2,4-dimetoxi- benzoil -1,10 — Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás in vivo fibrinolitikus hatású enzimszármazékok előállítására, azzal jellemezve hogy a kiindulási anyagként alkalmazott in vivo fibrinolitikus enzimben, előnyösen humán plazminban, sztreptokináz-humán plazminogén aktivátor komplexben vagy ezek elegyében a fibrinolitikus aktivitás szempontjából lényeges katalitikus helyekre benzoil-, szubsztituált benzoil-p-amidinc-fenil-észterrel, továbbá akriloil-, szubsztituált akriloil-p-amidino-fenil-észterrel reagáltatjuk, amikor is a kapott vegyidet pszeudo-elsőrendű hidrolízis-sebességi állandója izotóniás vizes közegben 7,4 pH-értéken, 37 °C hőmérsékleten 10~6 sec1 és io-3 sec-1 közötti értékű, mi mellett a benzoil-csoport szubsztituensc a p-guanidino-csoporttól eltérő. 2. Az 1. igénypont szerint i eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy védőcsoport-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
