182458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás in vivo fibrinolitikus hatású enzimszármazékok előállítására
5 182458 6 cava-jában radioaktív izotóppal jelzett vérrögöt képezünk. A vizsgálandó szert azután bevezet jük a véráramba egy olyan helyen, ahonnan annak keresztül kell haladnia a szíven, hogy ezzel biztosítsuk a szefalapos keveredését a vénás vérrel. A nemspecifikus litikus enzimek megtámadják a vérfehérjéket és ezzel az állat elhullását okozzák, mielőtt még a vérrög oldódása lenne megfigyelhető. Az olyan enzimek azonban, amelyek bizonyos mértékű specificitást mutatnak a fibrin iránt, már a letális adagnál kisebb adagban oldják a vérrögöt. A vérrög oldódásának bekövetkezését radioaktív f ragmen - seknek a felszabadulása és a véráramba kerülése bizonyítja. Az ,,in vivo fibrinolitikus enzim” kifejezés e leírásban oly enzimeket jelent, amelyek egy az inferior vena cava valamely részében rögzített, radioaktív izotóppal jelzett vérrögnek a kísérleti nyálban való létrehozása után 5 órán belül beadva, a szer beadás után legfeljebb 5 órán belül a vér rádióaktivitásszintjét legalább az eredeti szint kétszeresére emelik, anélkül, hogy az állat elhullását okoznák. E vizsgálati módszer egyik előnyös kiviteli módja a következő : Egy 2,5—3,5 kg súlyú fehér New Zealand fajtájú nyulat érzéstelenítünk és három kanült vezetünk be a vénákba, az 1. kanült az elülső faciális vénába, a 2. kanült a baloldali artéria carotisba és a 3. kanült a baloldali külső vena iliaciusba. Ezután laparotómiát (hasfelmetszést) végzünk a nyálon, hogy kiszabadítsuk az inferior vena cava ania részét, amely a baloldali vese-vénával való kapcsolat közelében van. Az inferior vena cava e szakaszát elkötjük az említett hely közelében és egy zárókapcsot helyezünk el az inferior vena cava egy további részén, a baloldali külső vena iliacus közelében. A radioaktív izotóppal jelzett vérrögöt oly módon képezzük, hogy 100 gl radioaktív jóddal jelzett humán fibrinogén és 150 jxl nyúl-tromboplasztin elegyéből 50 gl mennyiséget injektálunk a véna fenti módon elzárt szakaszába. Az említett 50 pt.1 injektálandó mennyiséget tetszőlegesen határoztuk meg ; ez egy közbülső adagot képez a még pontosan mérhető minimális mennyiség és az elkülönített véna-szakasz fiziológiai feltételeinek túlságos megzavarása nélkül injektálható maximális mennyiség között. A véráramba felszabaduló rádióaktivitás mérésének szempontjából lényeges, hogy a vénába injektált rádióaktivitás mennyisége ne legyen kisebb mint 0,25 [xC, és célszerűen 0,25 gC, és 1,0 ,u.C, között legyen. Az injekciós tű fölé azon a helyen, ahol a tű behatol az inferior vena cava külső falába, egy vérrög-tampont helyezünk, hogy ezzel felszívjunk minden rádióaktív anyagot és egyéb folyadékot, amely kiléphet az injekció helyén. Ezután egy második 50 [xl adag fibrinogén-tromboplasztin elegyet vakpróbaként egy rádióaktivitás-számláló ampullába és meghatározzuk ennek gamma-sugárzási szintjét, vagy folyadék-szcintilláció-számlálással, vagy pedig közvetlen gamma-számlálással, nátriumjodid-kristály módszer alkalmazásával. Ez a vakpróba mutatja a kísérleti állatba injektált rádióaktivitás mértékét. Az első vérrög-tampont annyi ideig hagyjuk a helyén, amennyi elegendő az összes kezdeti szivárgás felfogására (erre általában 5 perc elegendő), majd egy második vérrög-tampont teszünk a helyébe. Az első tampont egy számlálócsőbe visszük és mérjük a gamma-sugárzás szintjét. A 3. kanült előre visszük egészen a fent említett szorítókapocsig, majd a fibrinogén-tromboplasztinelegy injektálása után 10 perccel 0,5 ml 500 u/rn 1 koncentrációjú heparin-oldatot adunk be a 3. kanülön keresztül. A heparin-injekciónak az a célja, hogy korlátozzuk a véralvadás mértékét, hegy megelőzzük ezáltal azt, hogy a túlságos mértékű véralvadás következtében számottevő mennyiségű jelzetlen endogén nyúl-fibrin kerüljön a kísérleti vérrögbe. Ez azért szükséges, mert ha számottevő mennyiségű jelzetlen anyag kerülne a vérrögbe, akkor ellenőrizetlen lízis következhetne be, minthogy jelzetlen lízis-terniékek szabadulnának be a véráramba, ez számottevő mértékű tévedést okozhat például olyan esetekben, amikor a rádióaktívan jelzett vérrög jelzetlen anyagba ágyazódnék be. Ezután a fent említett véna-elkötést részlegesen megnyitjuk, oly mértékben, hogy az inferior vena cava normális átmérőjének körülbelül 40—60%-ára legyen összeszorítva. Ez az összeszorítás azért szükséges, hogy meggátoljuk a vérrög elmozdulását. A szorítókapcsot azután eltávolítjuk és 1,0 ml 500 g/ml koncentrációjú heparin-oldatot adunk be a 2. kanülön keresztül, hogy gátoljuk a véralvadást az állatban és ezzel megelőzzük, hogy a kísérlet céljaira szükséges vérrögön "kívül további vérrögök is képződjenek. Ezután ellenőrizzük, hogy nem lépett-e fel vérzés; ha tartós vérzés mutatkozik, akkor ezt egy trombinnal impregnált tampon alkalmazásával megállítjuk. A rádióaktív anyag injektálása után 15 perccel 1,8 ml vér-mintát veszünk el a 2. kanülön keresztül és trinátrium-citrát-pufferoldat (0,2 ml, 3,8 súly/tf% koncentrációval) hozzáadásával gátoljuk a kivett vérminta megalvadását ; az így hígított vér-mintát (P0) megvizsgáljuk a gamma-sugárzás mértékének meghatározása céljából; a meghatározást vagy folyadék-szcinti Uáció-számlálással, vagy nátrium-jodid kristály-módszerrel történő közvetlen gamma-számlálással végezzük. Ez a gammasugárzás-mérés a véráramban fennálló radioaktivitás mértékét adja meg. A vérrögöt azután 4,0 ml sóoldat 0,2 ml/perc sebességgel történő infúziója útján mossuk a 3. kanülön keresztül, hogy ezzel kimossunk minden exogén rádióaktív anyagot a véráramba és elősegítsük a további vérrög-képződés meggátlását minden esetleg jelenlevő trombogén anyag kimosása útján. Ezután egy második vérmintát (P10) veszünk és ezt is citrát-pufferoldatba visszük a fenti módon, majd a fentebb leírt módon mérjük ennek a vérmintának is a gamma-sugárzását. Ezt a második (P10) vérmintát 10 perccel a P„ vér-minta vétele után vesszük. A P10 vér-minta rádióaktivitásának a mérése annak ellenőrzésére szolgál, hogy további rádióaktivitást nem mostunk - e a véráramba ; ez a mérés tehát a kísérleti vérrög stabilitásának az ellenőrzésére szolgál. 20 perccel a P„ vér-minta vétele után a sóoldat infúzióját megszakítjuk, majd egy további vérmintát veszünk (t = 0 időpontban) és megkezdjük a vizsgálandó enzim infúzióját. Egyúttal mérjük a t = 0 időpontban vett vér-minta sugárzását is ; a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
