182458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás in vivo fibrinolitikus hatású enzimszármazékok előállítására
7 182458 8 kapott érték a háttér-rádióaktivitás mértékét mutatja. Az enzim-adagot szisztémás infúzió útján adjuk be, majd az infúzió megkezdésétől számított 6 óra folyamán 30 percenként 2—2 ml vér-mintát veszünk. Minden egyes minta rádióaktivitását mérjük közvetlen gamma-számlálással (nátrium-jodid kristály-módszerrel) vagy folyadék-szcintilláció-számlálással; ex vivo mérjük a szabad plazmin-aktivit-ást. A kísérleti állatnak beadandó enzim-adagot próbálgatással szabjuk meg oly módon, hogy pozitív aktivitást kapjunk, anélkül azonban, hogy az állat elhullása következnék be. Az adag nagyságának megszabására tájékoztatásul megjegyezzük, hogy a humán plazmin 1-10-7—5 ■ 10-“ mól aktív katalitikus enzim-helyet tartalmazó adagja (a kísérleti állat 1 kg testsúlyára számítva) általában pozitív eredményt ad ebben a kísérletben; hasonlóképpen a sztreptokináz/plazminogén aktivátor-komplex 1 • 10"10—1 -10"8 mól/kg adagban ad pozitív eredményt. A proteolitikus aktív enzim-helyek koncentrációját — amennyiben ezt nem ismerjük — vagy kromogén vagy fluorogén titrálással határozhatjuk meg, vagy pedig oly módon, hogy meghatározzuk az enzim analitikai tisztaságii mintájának molekulasúlyát és fajlagos aktivitását. Az alkalmazandó enzim-adagokat tehát a fentieknek megfelelő határok között tetszőlegesen állapítjuk meg. A választott adag 20%-át a kísérlet kezdetén adjuk be, míg a fennmaradó rész beadása folyamatosan történik a következő 2 órán belül. Ha az alkalmazott enzim-adaggal nem tapasztalunk aktivitást, akkor a kísérletet növekvő enzim-adagokkal megismételjük, mindaddig, míg aktivitást tapasztalunk vagy amíg az alkalmazott adag toxikussága nem szab határt a kísérletnek. Az infúzió időtartamát ilyenkor egészen 5 óráig növelhetjük. A fentebbi meghatározásnak megfelelő in vivo fibrinolitikus aktivitást mutató enzimek példáiként a következőket említhetjük: urokináz, sztreptokináz/plazminogén aktivátor-komplex, vaszkuláris aktivátor, különösen humán vaszkuláris aktivátor, továbbá különféle plazminok. különösen emlősállat-plazminok, mint juh-, sertés-, szarvasmarha-, ló-, majom- és humán plazmin. A találmány szerinti eljárásban különösen előnyösen humán plazmin, valamint sztreptokináz/ humán-plazminogén aktivátor-komplex alkalmazható. Azt tapasztaltuk, hogy különösen előnyös, ha humán plazmin és sztreptokináz-humán-plazminogén aktivátor-komplex elegyéből egy blokkolt származékot, különösen valamely acilszármazékot képezünk. Az ilyen elegyet célszerűen oly módon készítjük, hogy humán plazminogént sztreptokinázzal a szokásos módon aktiválunk és nem távolítjuk el az aktivátor-komplex teljes mennyiségét. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti készítményekben alkalmazott blokkolt (védett) enzimek a következő előnyöket mutatják a megfelelő szabad enzimekkel szemben : a) hatásosabbak a szabad enzimeknél; b) biológiai aktivitásuk hosszabb ideig megmarad; c) viszonylag alacsony toxikusságuk folytán egyetlen nagy adagban is beadhatók, míg a gyógyászatban jelenleg alkalmazott enzimeket, aktivátorokat illetőleg aktivátor komplexeket folytonos intravénás infúzióban kell beadni, néhány órán, sőt több napon át tartó infúzióval. Az enzimek, mint a plazminok önmagukban ismert módszerekkel állíthatók elő; ilyen módszereket például B. A. K. Chibber és munkatársai, Methods in Enzymol., 34. kötet, 424—432. old., K. C Robbins és K. Summaria, Methods in Enzymol., 45. kötet, 257—-273. old. ismertetnek. Kinyerhető a p'azrniriogén az 1 013 507, 1 066 467, 1 078 141 és 1 096 953 sz. brit szabadalmi leírásokban ismertetett módszerekkel is; az így kapott plazminogént ; azután a szokásos módszerekkel alakíthatjuk át plazminná. A humán vaszkuláris aktivátor D. 8. Pepper és m unkatársai, Progress in Che n. Fibrinolysis and Thrombolysis, 1978, 3., 91—-98. old. (Raven Press, (New York) által leírt módszerrel nyerhető. A sztreptokináz/plazminogén aktivátor-komplex előá’lítását D. K. McClintock és P. H. Bell, Biochem. Biophys. Res. Comm. 43, 694—-702. (1971) ismerteti. Az urokináz humán vizeletből különíthető el T. Macaig és munkatársai, Methods in Enzymol. 34, 4 >1—459 és G. H. Barlow, Methods in Enzymol. 45, 239—245 módszere szerint. Az enzim katalitikus helyeinek blokkolására szolgáló csoportok lényeges követelménye, hogy e csop irtoknak hidrolízissel eltávolíthatóknak kell lenniük, olyan sebességgel, hogy a hidrolízis pszeudoelsőrendű sebességi állandója legalább 10"* sec-1, de legfeljebb 10“3 sec-1 legyen. A sebességi állandó előnyös értéke 10-6 sec-1 és 10-3 sec-1 között van. Az olyan származékok ugyanis, amelyek pszeudoc-ső rendű sebességi állandója nagyobb, mint 10-3 sec-1, kedvezőtlenül nagy mértékben szabadítják fel a szabad enzimet, mielőtt a fibrinhez kapcsolódnának. Azok a származékok viszont, amelyek pszeudo elsőrendű sebességi állandója kisebb, mint 10-a sec-1, túlságosan lassan szabadítják fel az enzimet ahhoz, hogy klinikai célra alkalmazhatók legyenek. A találmány szerinti eljárással előállítható készítmények mind profilaktikus (megelőzési), mind terápiás szerekként alkalmazhatók. Profilaxis céljaira a kisebb hidrolizálási sebességű és ezért nagyobb felezési idejű származékok előnyösek. Az Byen célra alkalmas származékok pszeudo-elsőrendű hidrolízis-sebességi állandója 5-10-s—1-10-5 sec-1, felezési ideje pedig 3,5—16 óra lehet. Terápiás célokra előnyösebbek a gyorsabban hidrolizáló származékok, vagyis az olyanok, amelyek pszeudoelsőrendű hidrolízis-sebességi állandója 5 • 10"4— 7 • 10-5 sec-1, ami körülbelül 30 perctől 2 óráig terjedő felezési időnek felel meg. Az enzim-származékok pszeudo-elsőrendű hidrolízis-sebességi állandóját oly módon határozzuk meg, hogy az enzim-származékot fiziológiás körülmények között, tehát izotóniás vizes közegben, 7,4 pH-értéknél, 37 °C hőmérsékleten hidrolizáljuk. Szabályos időközökben aliquot-mintákat veszünk és ezeket kromogén vagy fluorogén proteázszubsztrátummal, például H-D-Val-Leu-Lys-p-niti'oa.nilid-dihidrokloriddal (S—2251) inkubáltatjuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
