182267. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-15003 P-3 antibiotikum előállítására
7 182267 8 zsírsav-észter mennyiségét izobutil-alkoholban adjuk meg. Előnyösen körülbelül 0,01—0,5 térfogat-százalék izobutil-alkoholt, annak zsírsav-észterét és/vagy izobutil-aldehidet adunk a táptalajba a táptalaj térfogatára számítva. Az adagolt anyagok mennyiségét azonban mindaddig növelhetjük, amíg az anyag(ok) nem gátolják a használt mikroorganizmus növekedését, vagy nem csökkentik a kívánt antibiotikum termelését. Az izobutil-alkoholt, annak zsírsav-észterét és/vagy az izobutir-aldehidet hozzáadjuk a táptalajhoz, mielőtt a sterilezett táptalajt beoltanánk a C-15003 termelő törzzsel, vagy a C-15003 törzsnek a táptalajba oltása során a C-15003 termelése közben. Az izobutil-alkohol zsírsav-észtereire példaként megemlíthetjük az 1—4 szénatomot tartalmazó zsírsavak észtereit (pl. formiát, acetát, propionát, butirát, izobutirát) az izobutil-alkohollal. Az ilyen C-15003 antibiotikumot termelő törzs tenyésztésére bármilyen szilárd vagy folyékony táptalaj alkalmas, ha a törzs által hasznosítható tápanyagokat tartalmaz. A magas termelőképesség eléréséhez előnyösen folyadék táptalajt használunk. A táptalaj tartalmazhatja a jelen találmány szerinti adalékanyagokat, a C-15003 antibiotikumot termelő törzs által beépített és felhasznált szén- és nitrogén-forrásokat, szervetlen anyagokat, nyomnyi mennyiségben szükséges tápanyagokat stb. Az említett szénforrásokra példaként megemlítjük a glükózt, laktózt, szacharózt, melaszt, maltózt, dextrint, keményítőt, glicerint, mannitot, szorbitot stb., zsírokat és olajokat (például szójaolaj, disznózsír, csirkezsír stb.) és így tovább. A nitrogén-forrás lehet például húskivonat, élesztőkivonat, szárított élesztő, szójaliszt, kukoricalekvár, pepton, gyapotmag-liszt, karbamid, ammóniumsók (például ammónium-szulfát, ammónium-klorid, ammónium-nitrát, ammónium-acetát stb.). A táptalaj tartalmazhat továbbá nátrium-, kálium-, kalcium-, magnézium-sókat, a vas, mangán, cink, kobalt, nikkel fémsóit, valamint a foszforsav és bórsav stb. sóit. Továbbá a táptalaj szükség esetén tartalmazhat vitaminokat, nukleinsavakat és így tovább. A táptalaj pH-jának beállítása céljából savakat és/vagy lúgokat adagolhatunk. A habzás csökkentésére megfelelő mennyiségű olajat, zsírt vagy felületaktív anyagot adhatunk a táptalajba. A tenyésztést végezhetjük álló, rázott, süllyesztett, levegőztetett vagy más tenyésztési körülmények között. A magas termelési szint eléréséhez természetesen előnyösen süllyesztett levegőztetett tenyésztési körülményeket használunk. Mivel a tenyészet állapota természetesen függ a táptalaj-összetételtől, a használt törzstől, a tenyésztési módszertől és más faktoroktól, a tenyésztést normál körülmények között előnyösen 5,5 és 8,0 kezdő pH-érték mellett végezzük, előnyösen a 6,5—7,5 pH-tartományban, 15 és 35 °C közötti hőmérséklet-tartományban, előnyösen 20 és 30 °C között. A tenyésztést a P-3 antibiotikum maximális koncentrációjának eléréséig végezzük. A tenyésztési idő a tenyésztési módszertől, hőmérséklettől, táptalaj-összetételtől függően változik, általában 48 és 240 óra között mozog. Az ily módon speciálisan előállított P-3 kinyerésére és tisztítására az ilyen mikrobiális eredetű termékek (metabolitok) elválasztására és tisztítására rendszerint ismert eljárást használunk. Mivel a kívánt termék zsíroldékony semleges anyag, a terméket könnyen extrahálhatjuk a tenyészléből vagy szűrletből vízzel nem elegyedő, szerves oldószerrel, mint zsírsav-észterekkel (pl. etil-acetát, amil-acetát) ; alkoholokkal (pl. butanol) ; halogénezett szénhidrogénekkel (pl. kloroform), és ketonokkal (pl. metil-izobutil-keton). Az extrakciót semleges pH-n végezzük, előnyösen pH=7-en etil-acetáttal. Az extraktumot vízzel mossuk, és csökkentett nyomáson bepároljuk. Ezután apoláros oldószert adunk a betöményített oldathoz (pl. petroléter, hexán), és az aktív vegyületeket tartalmazó nyersterméket csapadék formájában elválasztjuk. A nyersterméket ezután a szokásos tisztítási eljárásoknak vetjük alá. Megszokott, rutin tisztítási eljárás gyanánt az adszorpciós kromatográfiát használhatjuk, és erre a célra a következő általános adszorbensek, mint például szilikagél, aktivált alumínium-oxid, makroporózus-nemionos adszorbens gyanta stb. használhatók. A nyerstermékben lévő P-3-at petroléterrel vagy hexánnal vihetjük fel a szilikagél kromatográfiás oszlopra, és poláros oldószerrel, mint például etil-acetát, aceton^etanol, vagy metanol, vagy halogénezett szénhidrogénnel, mint például diklór-metán, vagy poláros oldószerként alkoholt (pl. metanol, etanol) tartalmazó kloroformmal, ketonnal (pl. aceton, metil-etil-keton), vagy hasonlókkal oldjuk le. Ily módon a P-3-at leoldjuk, elválasztjuk és kinyerjük. Ha makroporózus-nemionos adszorbens-gyantát használunk a P-3 tisztítására az oszlopról, víz és ala;sony szénatomszámú alkohol, keton vagy észter keverékével oldjuk le a P-3-at. Az alacsony szénatomszámú alkohol lehet például metanol, etanol, propanol vagy butanol stb., az alacsony szénatomszámú keton lehet például aceton vagy metil-etil-keton stb. Az észter lehet például etil-acetát. Egy tipikus eljárás során a nyersterméket 60% metanol-víz elegyben oldjuk és Diaion— HP—10 (Mitsubushi Chemical Industries, Ltd., Japan) oszlopon adszorbeáljuk. Az oszlopot 70%-os metanolvíz eleggyel mossuk és P-3-at 90%-os metanol-víz eleggyel eluáljuk. A fenti eljárás során nyert P-3 tartalmú frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson besűrítjük. A száraz termékhez 5—8 térfogat etil-acetátot adunk, a keveréket állni hagyjuk, amiután a P-3 kikristályosodik. A C-15003 antibiotikum fizikai-kémiai tulajdonságait, amelyek a 4.162.940. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban is szerepelnek, az alábbi 4. táblázatban mutatjuk be. 4. táblázat C—15 003 P—3 antibiotikum C32H43CIN2O9 = = 635,169 Olvadáspont (°C) 190—192° Fajlagos forgatás-136 + 10° [*]“' (C=0,375 CHCI3) Elemanalízis C 60,06 talált érték (%) H 7,04 N 4,33 Cl 5,37 Elemanalízis C 60,51 számított érték (%) H 6,82 N 4,41 Cl 5,58 Ultraibolya elnyelési 233 (30 250), 240 (sh 28450), spektrum nm (E) 252 (27640), 280 (5750), (metanolban) 288 (5700) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
