182255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikofenolsav-származékok előállítására
3 182255 4 szennyezőkként fordulhatnak elő olyan mennyiségben, amely kielégíti a növekedési és bioszintézis-követelményeket. Előnyös azonban, ha a tápközegbe további oldható szervetlen tápsókat viszünk be, amelyek vas, nátrium, kálium, magnézium, ammonium, kalcium, fősz- 5 fát, klorid, karbonát, szulfát, nitrát és hasonló ionokat szolgáltatnak. A tápközeg kezdeti pH-ja változó lehet. Az organizmussal való beoltás előtt azonban a tápközeg pH-ját 5,7 és 7,5 közé kell beállítani az alkalmazott közegtől 10 függően/Mint más Actinomycètes esetében, a közeg itt is fokozatosan alkalikussá válik a fermentáció előrehaladásával és a kezdeti 5,9 pH-ról 6,9 pH-ra vagy még nagyobbra növekedhet az organizmus fejlődése folyamán. A végső pH-t befolyásolja a közeg kezdeti pH-ja, a 15 közegben levő anyag és a pufferek, valamint az az idő, ameddig az organizmust fejlődni hagyjuk. A pH-t sav vagy bázis hozzáadásával módosíthatjuk ugyan, de jó eredményeket akkor érünk el, ha a pH-t nem módosítjuk. 20 Más Streptomyces fajtákhoz hasonlóan a mikroorganizmusok is levegőigényes tenyésztési körülményeket kívánnak meg. Kis térfogatú tenyésztést és szaporítást kényelmesen ferde agar kultúrán vagy lemezeken, rázópalackban vagy rázólombikban végezhetünk. Nagy- 25 méretű szaporítás alámerített levegőztetett tenyészetben nagy tartályokban végezhető előnyösen. A fermentációs közeget valamely steril tartályban spóraszuszpenzióval oltjuk be a fermentáció megindítása érdekében. Mivel azonban a spóraszuszpenzióval törté- 30 nő beoltás a fejlődés késlekedését vonja maga után, ezért előnyös valamely vegetatív inokulum. A vegetatív inokulumot úgy készíthetjük, hogy a tenyészközeg kis térfogatát beoltjuk az organizmus spóra-alakjával vagy micélium-töredékével és így az organizmus friss, aktívan 35 fejlődő tenyészetét kapjuk. A vegetatív inokulumot ezután átvisszük a nagy tartályba. A vegetatív inokulum tenyésztéséhez használt közeg ugyanaz lehet, mint a nagyméretű tenyésztésnél alkalmazott közeg, de más talajok is használhatók. 40 Az S. aureofaciens NRRL 2209 20 C° és 37 C° közötti hőmérsékleten fejlődik. A legnagyobb fejlődés és spóraképződés azonban 28 C° és 32 C° között megy végbe. 45 Az S. candidus NRRL 5449 organizmus 26 C° és 40 C= közötti hőmérsékleten fejlődik és a spóraképződés 32 C és 37 C° között történik. Ahogy ez szokásos a levegőztető alámerített tenyésztési eljárásoknál, steril levegőt fúvatunk át a tápközegen a 50 fermentáció folyamán. Az organizmus hatásos fejlődése és mikofenolsavglükozid termelése érdekében az anyagnak a tartályban történő termeléséhez használt levegő térfogata 0,1 térfogat levegő felett van egy térfogat tápközegre számítva percenként (V/V/M). Optimális ki- 55 termeléseket akkor kapunk, ha legalább '/3—V2 térfogat levegőt használunk egy térfogat tápközegre számítva percenként. Az átalakuláshoz szükséges fermentációs idő változó 60 lehet. Egyenértéknyi mennyiségű glükóz jelenléte lényeges. Általában, ha a glükóz elegendő mennyiségben van jelen és a mikofenolsav mennyisége 0,1—1,0 g/liter közeg, akkor a mikofenolsavnak mikofenolsavglükoziddá való átalakulása lényegében 72—120 óra alatt befejező- 65 dik. Optimális átalakulás megy végbe akkor, ha a mikofenolsav 0,2—0,75 g mennyiségben van jelen egy liter közegben. Elegendő mennyiségű a glükóz, ha a közeg 1 súly%-a felett van. Az előnyös glükózmennyiség a közeg 2—5 súly %-át teszi ki. A glükóz kimutatására valamely glükózra érzékeny indikátor-papírt használhatunk, amellyel megállapíthatjuk a koncentráció-szinteket. Abban az esetben, ha a glükóztartalom körülbelül két százalék alá csökken, glükózt adagolunk annak érdekében, hogy annak optimális koncentráció-szintjét fenntartsuk. Egy más módszer a konverzió kivitelezésére abban áll, hogy a szakterületen ismert módon rögzítjük (immobilizáljuk) az enzimet („Biomedical Applications of Immobilized Enzymes and Proteins”, Thomas Ming Swi Chang, Ed., Plenum Press, New York, 1977; Vol. 1.). A rögzített enzimet ezután valamely oszlopban (vagy más alkalmas típusú reaktorban) használhatjuk a glükozilezési reakció végrehajtásánál. Ezenkívül a mikroorganizmus maga is rögzíthető és felhasználható a glükozilezési reakció katalizálására. Az átalakulás előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) követhetjük UV-fényt használva a kimutatásra. Szilikagélen végezve a TLC-t (9 : 1 arányú) acetonitril : víz elegy eluáló szer használata esetén az Rf-érték mikofenolsavra körülbelül 0,62, míg az Rférték mikofenolsavglükozidra körülbelül 0,45. A mikofenolsavglükozid mind a táptalajban, mind a micéliumokban jelen van. Ennek megfelelően alkalmas technikai módszerek használhatók a mikofenolsavglükozidnak az elkülönítésére annak érdekében, hogy a lehető legnagyobb mértékű kitermelés váljék lehetővé egyik vagy mindkét forrásból. így például a fermentációs közeget szűrjük, a szűrlet pH-ját a savas tartományra lecsökkentjük és a savas szűrletet megfelelő oldószerrel, így kloroformmal, extraháljuk minden reagálatlan mikofenolsav eltávolítása érdekében. Ezenkívül a micella-pogácsát megfelelő oldószerrel, így metanollal, extraháljuk, a szerves oldószert eltávolítjuk és a vizes oldatot, amely visszamarad, hozzáadjuk a szűrt talajhoz az elkülönítő lépésben. A terméket a szakterületen ismert módszerekkel nyerjük ki az oldatból. Egy előnyös kinyerési módszer a terméknek valamely polimer gyantán való adszorbeálása és megfelelő oldószerrel, így metanol/víz-eleggyel történő eluálása. A találmány szerinti eljárást kiviteli példákon is bemutatjuk. I. példa Mikofenolsavglükozid előállítása S. aureofaciens enzim felhasználásával AJ S. aureofaciens fermentációja Liofilizált Streptomyces aureofaciens NRRL 2209 törzset vízben szuszpendálunk és felhasználjuk a következő összetételű agar ferde tenyészet beoltására : 2
