182255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikofenolsav-származékok előállítására
5 182255 6 Alkotóanyag Mennyiség dextrin 10 g kazein enzimes hidrolizátúrna* 2g marhahús-kivonat 1 g élesztő-kivonat 1 g Czapek-féle ásványi törzsoldat** 2 ml agar 20 g víz szükséges mennyiség pH 5 n NaOH-oldattal 7,3-ra beállítva 1 literre * N-Z-amin A (Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, N. J.). ** Czapek-féle ásványi törzsoldat. KC1 100 g MgS04.7H20 100 g ionmentesített víz 900 ml FeS04.7 H20 2g 100 ml olyan ionmentesített vízben oldva, amely 2 ml tömény HCl-t tartalmaz. Ezt az oldatot hozzáadjuk a fenti KCl/MgS04.7 H20-oldathoz a Czapek-féle ásványi törzsoldat elkészítése céljából. A beoltott ferde tenyészeteket 30 C°-on inkubáljuk 10 napig és utána 4 C°-on állni hagyjuk legfeljebb 30 napig-Egy kacs-inokulumot a ferde tenyészetből átviszünk egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml menynyiségű vegetatív közegbe. A vegetatív közeg összetétele a következő : Alkotóanyag Mennyiség glükóz 15 g szójababliszt 15 g kukoricaáztató folyadék 10 g tapióka-dextrin* 20 g CaC03 4 g Czapek-féle ásványi törzsoldat 2 ml ionmentesített víz szükséges mennyiség 1 literre pH 5 n NaOH-oldattal 7,0-re beállítva * Stadex 11 (A. E. Staley Co., Decatur, 111.). A beoltott lombikot 30 C°-on inkubáljuk egy 250 ford/ perc sebességgel forgó rotációs rázóban, majd 48 órás inkubálás után 5 ml tenyészetet átviszünk 100 ml második állapotú vegetatív közegbe (amelynek az összetétele megegyezik az említett vegetatív közeg összetételével), amelyet egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba teszünk. Ezt a tenyészetet 30 C°-on 48 óra hosszat inkubáljuk 250 ford/perc sebességű rotációs rázóban. B) Mikofenolsavglükozid előállítása 50 mg mikofenolsavat feloldunk 8 ml vízben. Az oldat pH-ját 7,0-re állítjuk be és a térfogatát vízzel 10 mire növeljük. Ezt az oldatot az A) pontban leírt lombikba visszük, amely az S. aureofaciens enzimet tartalmazza, 250 mg/ml glükózt tartalmazó 4 ml mennyiségű vizes oldattal együtt. A lombikot ezután további 72 óra hoszszat inkubáljuk. Az átalakulás siettetése érdekében egyenlő mennyiségű fermentációs táptalajt szabályos időközökben etilacetáttal extrahálunk. Ezeket a kivonatokat szilikagélen vékonyréteg-kromatográfiásan vizsgáljuk (9 : 1 arányú) acetonitril-víz oldószer-rendszer használata mellett és UV-fényt alkalmazunk a kimutatásra. Abban az esetben, ha a kromatogram azt mutatja, hogy az összes mikofenolsav átalakult glükoziddá, akkor a fermentációt megszüntetjük. Egymást követő kísérletek azt mutatták, hogy további mikofenolsav és glükóz adagolásával, majd ezt követő inkubálással további 24—48 óra alatt nagyobb menynyiségű termékhez juthatunk. C) A termék elkülönítése és tisztítása 49 lombik B) pont szerint kapott mikofenolsavglükozid-tartalmú anyagát egyesítjük. A táptalaj pH-ját körülbelül 7,6 és 4,0 között állítjuk be HCl-lel. Ezután szűrést elősegítő segédanyagot (Hyflo Super-cel, diatomaföld, Johns-Manville Products Corp.) adunk az egyesített táptalajhoz és a keletkező elegyet szűréssel elkülönítjük. A micella-tömeget (amely a szűréstelősegítő anyagot is tartalmazza) metanollal extraháljuk. A metanolos kivonatot szűréssel elkülönítjük és vákuumban betöményítjük a metanol eltávolítása érdekében. A keletkező vizes oldatot a táptalajszűrlethez adjuk. Az oldat pH-ját HCl-lel 4,0-re állítjuk be. Az oldatot ezután egyenlő térfogatú kloroformmal extraháljuk a visszamaradó mikofenolsav eltávolítása érdekében. A visszamaradó vizes oldatot vákuumban egy literre betöményítjük, és egy 62 cmx40 mm méretű OD oszlopon kromatografáljuk, amelyet 700 ml polimer adszorbens-gyantával (XAD—2, Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pa) töltünk meg. Az oszlopot 4 liter ionmentesített vízzel mossuk és utána metanol/víz-eleggyel eluáljuk. Az oszlop haladását vékonyréteg-kromatográfiásan követjük a B) pontban leírtak szerint. Az eluálást 4 liter (1 : 7 arányú) metanol/víz-eleggyel, utána 8 liter (1: 3 arányú) metanol/víz-eleggyel és végül 8 liter (1 : 1 arányú) metanol/víz-eleggyel végezzük. A glükozidot (1 : 1 arányú) metanol/víz-eleggyel eluáljuk. A mikofenolsavglükozid frakciókat egyesítjük és vákuumban betöményítjük. Ily módon részben tisztított terméket kapunk. A mikofenolsavglükozid végső tisztítását úgy végezzük, hogy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát alkalmazunk, ahol C18 szilikagélen fordított fázist használunk (amelyet az 5. példában ismertetésre kerülő módon állítunk elő). Az XAD—2 oszlopról lekerülő termék egy részét (200 mg) egy 28 cm x 20 mm méretű OD Clg szilikagél-oszlopon kromatografáljuk, amely a 6. példában leírt módon van töltve. Az oszlop 7 atmoszféra nyomáson és 7 ml/perc áramlási sebességgel dolgozik. Az oszlopot (65 : 35 arányú) víz/metanol-eleggyel eluáljuk és az eluátum összetételét UV abszorpcióval követjük 250 nm-nél. A távozó eluátumból 20 ml-es frakciókat fogunk fel, a mikofenolsavglükozid a 22—33. frakcióban van jelen. A glükozidot tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban betöményítjük. Ily módon 111 mg tisztított mikofenolsavglükozidot kapunk. A termék fizikai-kémiai analízise azt mutatja, hogy azonos a kémiai úton előállított 6-[4-( ß-D-glükopiranozil)-6- -metoxi-7-metil-3-oxo-5-ftálalanil]-4-metil-4-hexánsavval, amely a 3 903 071 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban van leírva. 5 10 15 20 25 30 35 40 45-50 55 60 65 3
