182234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertések gastroenterítise elleni vakcina előállítására
7 182234 8 beállítani, amely a vakcina készítéséhez szükséges. Ez az érték közelítőleg 1 mg/ml összes protein, ami körülbelül 0,5 mg/ml SPA-nak felel meg, ami a „B” sáv proteinjének körülbelül 50%-a. A szacharózt az oldatban hagyhatjuk, de dialízissel el is távolíthatjuk. Ha az oldatot a tárolás érdekében fagyasztjuk, a szacharóz védőhatást fejt ki. 9. Ha szükséges, a „B” sáv oldatának proteinkoncentrációját megnövelhetjük úgy, hogy az oldatot polietílénglikollal szemben dializáljuk, vagy csökkenthetjük annyi trisz-izotóniás konyhasó-puffer hozzáadásával, hogy az összes protein-koncentráció körülbelül 1 mg/ml legyen. 10. A „B” sáv protein-oldatát, amelyet a 7. lépésben kapunk, elkülöníthetjük és tovább tisztíthatjuk Sephadex G 200 alkalmazásával végzett gélszűréssel. A gélszűrést felszálló módszerrel végezzük, 6 ml/óra áramlási sebességgel, trisz-konyhasó puffert használva. Két komponenst kapunk, külön-külön eluált frakciók formájában. Az SPA a második eluált frakció, és a „B” sávban levő két proteinmolekula közül a kisebb. Nátriumdodecilszulfát jelenlétében végzett poliakrilamid-gélelektroforézissal az SPA protein Rf-értéke 1,84 ±0,01 (humán szérumalbuminhoz viszonyítva). A „B” sáv másik proteinjének (amelynek ugyancsak 1,02—1,03 g/ml a fajsúlya) azonos módon meghatározott Rf-értéke 1,40 ±0,01. Az SPA ímmunogén számított molekulasúlya körülbelül 25 000 és a „B” sáv másik vírusproteinjének számított molekulasúlya körülbelül 32 000. Az izolált SPA-t, amely a „B” sáv másik proteinjétől mentes, vakcina termelésére használjuk. 2. példa Az 1. példában leírt „B” sáv proteinjéből vagy az izolált SPA proteinből intramuszkulárisan adható vakcinát készítünk. Ebből a célból a vírusproteint alumínium-hidroxid adjuváns vizes oldatában szuszpendáljuk. A vakcina 1,0 mg „B” sáv proteint tartalmaz milliliterenként, vagy 0,5 mg/ml SPA-t. Az alumínium-hidroxid koncentrációt körülbelül 0,5%-ra (A1203 alapján) állítjuk be. A „B” sáv és az SPA protein említett koncentrációi mellett körülbelül 2 ml-es dózisokat használunk, s így dózisonként körülbelül 1,0 mg SPA-t adunk be. Sertések vakcinációjára kétoltásos rendszert alkalmazhatunk. Az első dózist az ellés előtt néhány hónappal, illetve 5—7 héttel az ellés előtt adhatjuk be. így például minden sertést egyidőben vakcinálhatünk, ha ezt ősszel, körülbelül november első hetében végezzük. A második vakcinadózist az első oltás után néhány héttel adjuk be, azaz 2—4 héttel később, de ez egészen az ellés idejéig adható. Az SPA immunogént egyetlen 2 ml-es dózisban is beolthatjuk, 5—7 héttel az ellés előtt. A kétoltásos rendszer azonban kedvezőbbnek látszik a malacok leghatékonyabb passzív immunizálása szempontjából. Minden oltást intramuszkuláris injekció formájában adunk be. 3. példa Kísérleti célokra, az 1. példában leírt módon előállított „B” sáv proteint komplett Freund-adjuvánssal kombinálunk úgy, hogy egyenlő arányban keverjük az adjuvánst és a milliliterenként körülbelül 0,5 mg SPA-t tar talmazó „B” sáv proteinjének vizes oldatát. A „B” sáv proteinoldatát is keverjük alumínium-hidroxid adjuvánssal, s így olyan vakcinát készítünk, amely milliliterenként 0,5 mg SPA-t tartalmaz 0,5% alumínium-hidroxid koncentrációval (A1203 alapján). Mindkét vakcinát 2 ml mennyiségű dózisokban használjuk vakcinálási kísérleteinkben, ahogy ezt a következőkben összefoglaljuk. Vakcinálási kísérletek Két vakcinálási kísérlet adatait írjuk le, amelyeket TGE—SPA immunogénnel tenyészsertéseken végeztünk. Az elsőben egy sertést immunizáltunk úgy, hogy a készítményt először Freund-féle komplett adjuvánssal adtuk be, majd Freund-féle inkomplett adjuvánssal, két emlékeztető oltásban. Ez az állat háromszor fialt. A második kísérletben négy fiatal kocát immunizáltunk TGE—SPA immunogénnel alumínium-hidroxid adjuvánssal. Ezek az állatok csak egyszer fialtak. 1. 831. koca — Freund-féle komplett adjuváns Egy „duroc”-fajta (Amerikai Egyesült Államok) első almos, TGE szeronegatív fiatal kocát 2 ml (körülbelül 1 mg) TGE—SPA immunogénnel Freund-féle komplett adjuvánsban ellés előtt 6 héttel immunizáltunk. Fialás előtt két héttel emlékeztető oltást kapott TGE—SPA immunogénnel, Freund-féle inkomplett adjuvánsban. aj 1. kísérlet, első ellés. A sertés 13 malacot fialt; mind igen kicsi volt. Az ellés utáni napon a koca tejének TGE antitest-titere 534, szérumtitere 178 volt. A malacok egyik felét 3 napos korukban 1 ml Illinois-i TGE vírussal (50—100 PID50) (PID50=ötven disznóra fertőző adag) orálisan megfertőztük, a másik fele természetes módon kaphatta meg a betegséget az alomban levő fertőzött malacoktól. A fertőzés után egyik malac sem mutatta egyszer sem a TGE klinikai tüneteit, és amikor négy és fél hónapos korukban leölték őket, mindegyikben volt szérum-antitest; ebben az időpontban latens vírus nem volt kimutatható. A kontroll malacok TGE-ben hullottak el az orális fertőzés után. b) 2. kísérlet, második ellés. A sertést nem immunizáltuk mégegyszer a második ellés előtt. Ekkor a koca szérum TGE antitest-titere 38 volt. Az előtej TGE antitest-titere 125 volt és 3 nappal később a tejé 34. 50— 100 PÍD50 Ulinois-i TGE vírussal fertőzve az öt malac mindegyikén a TGE klinikai tünetei fejlődtek ki. A malacokból kettő (40%) elhullott a betegségben. c) 3. kísérlet, harmadik ellés. Az ellés előtt egy hónappal a sertésnek emlékeztető immunizáló oltást adtunk TGE—SPA immunogénnel, Freund-féle inkomplett adjuvánsban. A koca szérumtitere ekkor 33 volt. Az injekció helyén egy granuloma jelent meg. A fialás idején a szérum TGE antitest-titere 231 és az előtej antitestitere 625-néI nagyobb volt (legnagyobb hígítás). Ellés után 5 nappal a tej antitest-titere 700 volt. A TGE Ulinois-i vírustörzsből 50—100 PID50-dal végzett orális fertőzés után az alom hét malaca közül egyiken sem fejlődtek ki a TGE klinikai tünetei. A malacok fertőzése után két napon belül a koca granulomája az injekció helyén kétszer akkora lett. Minthogy egy malacon sem alakultak ki a TGE klini-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
