182234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertések gastroenterítise elleni vakcina előállítására
9 181234 10 kai tünetei az 50—100 PID50-dal végzett fertőzés utáni három napon belül, a fertőzés utáni negyedik napon az egyik malacnak a TGE Illinois-i vírustörzsből 5 x 104 PIDjo dózist adtunk. A TGE klinikai tüneteit nem észleltük sem a fertőzött malacon, sem az alom többi állatán. Néhány malacnál hasmenés alakult ki az elválasztás előtt (körülbelül 2 hetes korban). A hasmenés nem volt jellemző a TGE-re, e betegség más jele sem mutatkozott, és TGE-vfrust sem lehetett izolálni vagy kimutatni a hasmenéses székletből, vagy magukból az állatokból. Baktériumokat (csillós rövid pálcák) figyeltünk meg a székletben, bőséges mennyiségben. 2. Aluminium-hidroxid adjuváns Hat kereszttenyésztett, TGE vírusra szeronegatív, első almos fiatal kocát használtunk ebben a kísérletben. Négy kocát 5 héttel az ellés előtt vakcináltunk alumínium-hidroxidos (0,5% A1203) 2 mg TGE—SPA immunogénnel és kettő kontrollként szolgált. Egy második immunogén-dózissal 2 héttel a fialás előtt oltottuk be az előzőleg vakcináit fiatal kocákat. Minden malacot orálisan fertőztünk a TGE vírus Illinois-i törzsének 50— 100 PIDjo dózisával, 10%-os bélszuszpenzió formában, a fialás után, az 1—3. napon. A két kontroll koca malacai a fertőzés utáni 32. órában TGE vírusfertőzés tüneteit mutatták. A malacok 100%-a megbetegedett a két kontroll alomban. Az egyik alomban kilenc malac közül három és a másikban nyolc közül egy túlélte a fertőzést, így a halálozási arány 76%-os volt. A négy vakcináit koca közül kettőnek a malacain nem voltak megfigyelhetők a TGE klinikai tünetei. Ezek az almok kilenc malacból álltak, amelyeket 1 napos korukban fertőztünk (290. koca), illetve hat malacból, amelyeket három napos korukban fertőztünk (294. koca) a TGE vírus Illinois-i törzsének 50—100 PIDJ0 dózisával. A vakcináit fiatal kocák fennmaradó két almának malacainál a TGE enyhe klinikai tünetei (például enyhe hasmenés) fejlődtek ki, miután a malacokat az Illinois-i TGE vírus 50—100 PIDJ0 dózisával fertőztünk 3 napos korukban (291. koca) és 2 napos korukban (433. koca). A betegséget a kilenc malacnál a fertőzés utáni 56. órában megjelenő enyhe hasmenés jellemezte. Egy malac hullott el azonban csak TGE-ben (három malac a TGE fertőzéstől független okok miatt pusztult el). Két malac elhullását más okozta, mint TGE. 4. példa A találmány szerinti eljárással nagyüzemi vakcinatermelésnél az 1. példában leírt módszert követjük úgy, hogy a 7. lépésben a „B” sáv proteinjének kitermelésére folyamatos áramló sűrűséggrádiensen át centrifugálást alkalmazunk. Egyébként más protein-elválasztási és tisztítási módszereket is használhatunk, mint például az ultraszűrést, fordított ozmózist és a szelektív kicsapást. Az ultraszűrés módszerének alkalmazása esetén például az 1. példa 4. lépésében kapott reszuszpendált csapadékot ultrahangkezelésnek vetjük alá, mint ahogy azt a 6. lépésnél leírtuk (kihagyva az 5. lépést). Az ultrahanggal kezelt vizes szuszpenziót azután ultraszűrésnek vetjük alá. A „B” sáv proteinjét úgy kapjuk meg, hogy olyan üreges rostokat (hollow fibers) vagy membránt használunk, amelyek porozitása 50 000 molekulasúly alatti proteinek áteresztését lehetővé teszik, s így a „B” sáv mindkét proteinjét a szűrletben kitermeljük. Az Amicon Corporation cég (Lexington, Mass!) ultraszűrő berendezését használhatjuk. A „hollow fiber” típusú készülékeknél a Diaflo fibers H10 x 50 rostok használhatók. Annak érdekében, hogy az SPA proteint a „B” sáv másik proteinjétől elkülönítve kapjuk meg, az Amicon cég vékony-csatornás készüléke használható, olyan membránt választva, amely 30 000-es molekulasúlynál választ el. Ezek a WM30 vagy PM30 membránok. Az SPA protein a szűrletben gyűlik össze, míg a „B” sáv másik proteinje visszamarad. 5. példa Egy másik eljárásban az 1. példa 1—4. lépését végezzük el. A TGE vírus reszuszpendált csapadékát ezután nem ionos detergenssel kezeljük, s így a proteint kivonjuk. Ebből a célból Triton X-100-at vagy Nonidet P40-et adunk például a szuszpenzióhoz 0,1% koncentrációban. Az így kapott kivonatot azután izopiknikus centrifugálásnak vetjük alá, ahogyan azt az 1. példa 7. lépésében leírtuk, vagy a protein kitermelését más módon, a 4. példában leírtak szerint végezzük. A Triton X-100 gyártója: Rohm and Haas Co., Philadelphia, Penn., USA, forgalmazója: Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA. A Nonidet P40 gyártója: BDH Chemicals Ltd., Poole, Anglia. Jól ismert, hogy ezek a nemionos detergensek híg oldatokban képesek a vírusproteineket oldhatóvá tenni. A leírásban használt „polietilénglikol-6000” megjelölés olyan polietilénglikolt jelent, amelynek molekulasúlya 6000 és 7500 között van. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás a sertéseket fertőző gastroenteritis (TGE) infekció ellen megvédő vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy TGE-vírusbóI elkülönítve, a TGE-vírustól lényegében mentesen, specifikus protein-antigént (SPA) állítunk elő, amely i) vízoldható, ii) fajsúlya (buoyant density) 1,02—1,03 g/ml és fii) töltés-semleges elektroforetikus mobilitása (Rf-értéke) 1,84+0,01, a humán széramalbuminéhoz viszonyítva, és ezt a specifikus protein-antigént — adott esetben azonos fajsúlyú másik vírusproteinnel együtt — állatgyógyászati beadáshoz alkalmas hordozóval vagy adjuvánssal keverjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a specifikus protein-antigént TGE-vírus virulens törzséből állítjuk elő. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a vakcinát az 1,02— 1,03 g/ml értéktől eltérő fajsúlyú TGE vírusproteinektől mentesen állítjuk elő. 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan TGE- származású proteint használunk, amely lényegileg teljesen a fenti specifikus protein-antigénből áll. 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
