182209. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán leukocita interferon előállítására
Találmányunk alapja az a felismerés, hogy speciális összetételű tápoldat alkalmazásával az igen drága esszenciális aminosavakat tartalmazó tápoldatokkal kapott titerekkel meglepő módon azonos interferon-koncentráció érhető el és ily módon a drága, nehezen beszerezhető aminosavakat kiküszöbölhetjük. Találmányunk tárgya eljárás humán leukocita interferon előállítására a vér fehérvérsejtek (buífy coat) ammónium-kloriddal történő kezelése, a leukociták tápoldatban történő szuszpendálása, interferonnal történő előkezelése (priming), valamely interferon induktorral történő kezelése, majd az interferon tartalmú folyadéknak a sejtektől történő elválasztása útján, oly módon, hogy 175—350 mg/1 kalciumkloridot, 300—500 mg/1 kálium-kloridot, 175—500 mg/1 magnézium-szulfátot vagy azzal ekvivalens magnéziumkloridot, 5000—7000 mg/1 nátrium-kloridot, 200— 3500 mg/1 nátrium-hidrogén-karbonátot, 30—150 mg/1 nátrium-dihidrogén-foszfátot, 500—5500 mg/1 glükózt és adott esetben 0,05—0,2 mg/1 ferrinitrátot és 0,5—10% szérumot tartalmazó vizes tápoldatot alkalmazunk. A találmányunk szerinti eljárás előnyös foganatosítást módja szerint 200—300 mg/1 kalcium-kloridot, 300— 450 mg/1 kálium-kloridot, 200—400 mg/1 magnézium-szulfátot, 6000—6500 mg/1 nátrium-kloridot, 500—3000 mg/1 nátrium-hidrogén-karbonátot, 50—150 mg/1 nátrium-dihidrogén-foszfátot, 1000—5000 mg/1 glükózt és adott esetben 0,05—0,15 mg/1 ferri-nitrátot és 0,5—5% szérumot tartalmazó vizes tápoldatot alkalmazunk. A találmányunk szerinti eljárás különösen előnyös foganatosítási módja szerint 265 mg/1 kalcium-kloridot, 0,1 mg/I ferri-nitrátot, 400 mg/1 kálium-kloridot, 200 mg/1 magnézium-szulfátot, 6400 mg/1 nátrium-kloridot, 2750 mg/1 nátrium-hidrogén-karbonátot, 140 mg/1 nátrium-dihidrogén-foszfátot és 4500 mg/1 glükózt és 0,5—5% szérumot tartalmazó vizes tápoldatot alkalmazunk. Eljárásunk során kiindulási anyagként ACD-oldatban (citromsavat és dextrózt tartalmazó oldat) vagy ACD—AG- oldatban (citromsavat, dextrózt, adenint és guanint tartalmazó oldat) felvett friss vagy +4 °C-on legfeljebb 72 órán át tárolt emberi vér „buífy coat”-ot (fehérvérsejt) összegyűjtjük, egyesítjük és 0—10 °C-on tároljuk. E frakciót a vörösvérsejtektől ismert módon ammónium-kloridos kezeléssel választjuk el. Előnyösen oly módon járhatunk el, hogy a frakciót 0,5—1%-os, előnyösen 0,83%-os lehűtött vizes ammónium-klorid-oldattal elegyítjük, majd a vörösvértestek feloldódásáig 0—10 °C-os hőmérsékleten keverjük, végül a leukocitákat az elégyből centrifugálással vagy szűréssel kinyerjük. A leukocitákat ezután a fentiekben megadott összetételű speciális táp-oldatban szuszpendáljuk és az ammónium-kloridos kezelést megismételjük. A leukocitákat ezután a fenti összetételű táp-oldatban ismét szuszpendáljuk és a sejtszámot a fentiekben ismertetett összetételű, azonban 1—10% szérumot tartalmazó tápoldattal 10s—10s, előnyösen 107 értékre beállítjuk. E célra kezeletlen vagy ammónium-szulfáttal globulin-mentesített és dializált állati (borjú, ló, juh, sertés) vagy emberi szérumot illetve human albumint alkalmazhatunk. E táp-oldathoz előnyösen valamely antibiotikumot (pl. neomicint) is adhatunk, utóbbit 10—50, előnyösen 25 pg/ml mennyiségben. A sejteket ezután ismert módon interferonnal történő előkezelésnek (priming) vetjük alá. E célra nyers vagy tisztított humán leukocita vagy humán fibroblaszt interferont alkalmazhatunk. Az interferon mennyisége 10—1000, előnyösen 100 N.E./ml Az előkezelést 35—39 °C-on 0,5—5 órán át végezhetjük el. A sejteket ezután valamely interferon induktorral hozzuk érintkezésbe. E célra bármely megfelelő interferon induktort felhasználhatunk, előnyösen tisztított (humán vörösvértestre adszorbeált és eluált, ületve ultracentrifugált) vagy tisztítatlan (csirke allantois folyadékkal szennyezétt) SehdaT vagy Newcastle vírust. Az indukciót önmagában ismert módon végezhetjük el. Az indukció időtartama 6—24 óra, az alkalmazott hőmérséklet 35—39 °C, előnyösen 37 °C. Az induktor felhasznált mennyisége előnyösen 10—1000 HA egység/ml, különösen 100—200 HA egység/ml. Az ily módon kezelt leukocitákat kétféleképpen dolgozhatjuk fel. Eljárhatunk oly módon, hogy a leukocitákat ismert módon centrifugálással vagy szűréssel választjuk el a folyékony fázistól. A felül elhelyezkedő folyadék ill. a szűrlet tartalmazza a nyers interferont; e folyékony fázist ismert módon liofilizálva tárolhatjuk vagy tisztításnak vethetjük alá. A tisztítást különböző módszerekkel végezhetjük el, pl. kálium-rodaniddal [Cantell K. és tsai: „Publication of the Tissue Culture Association”, Monográfia 3. sz. (1974)] vagy gélszűréssel. Eljárásunk előnyös foganatosítási módja szerint veszteségekkel és ráfordításokkal járó külön tisztítási lépések nélkül közvetlenül ún. félig nyers (semi crude) interferont készíthetünk. Találmányunk ezen részének alapja az a felismerés, hogy a táp-oldat szérum-tartalmának lényeges csökkentésével idegen fehérjéket nem vagy csak minimális menynyiségben tartalmazó 50 000—100 000 NE/ml titeríx interferon állítható elő. Tápfolyadékcserével a csere nélkül előállító 11 in terferon mennyiségének a 60—70%-a nyerhető. Eljárásunk ezen igen előnyös foganatosítási módja szerint oly módon járunk el, hogy a leukocitákat 4—6%, előnyösen 5% szérumot tartalmazó, a korábbiakban megadott összetételű táp-oldatban 5 perctől 4 órán át — előnyösen 10—15 percig — 35—39 °C-on inkubáljuk az interferon induktor jelenlétében, majd a leukocitákat centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk, ezután 0,0—2,0%, előnyösen 0,5% szérumot tartalmazó, egyébként a fentiekben megadott összetételű táp-oldatban szuszpendáljuk és további 12—24 órán át 35—39 °C-on inkubáljuk. Az inkubáció után a sejteket és ülepítéssel eltávolítható egyéb anyagokat centrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk és az interferont tartalmazó, felül elhelyezkedő folyadékot, illetve szűrletet liofilizálva tároljuk vagy ismert módon tisztítjuk. Az ily módon nyert interferon specifikus aktivitása 105 NE/mg protein értéknél nagyobb, így költséges és veszteséget okozó tisztítási műveletek nélkül közvetlenül félig nyers (semi crude) interferonhoz jutottunk. A fenti módszer alkalmazása esetén a képződő interferont minimális mennyiségű idegen fehétje szennyezi és ily módon sokkal tisztább terméket kapunk. Az ily módon készített interferon felhasználása esetén az idegen fehérjék által okozott n idlékhatások sokkal kisebb mértékben lépnek fel, illetve a tisztítás sokkal egyszerűbb és a tisztítási veszteség számottevően kisebb. A 0,0—2,0% előnyösen 0,5% savót tartalmazó tápoldattal történő csere az induktor vírus hozzáadása előtt is elvégezhető. A tápfolyadékcsere ebben az esetben az előkezelésre használt interferon hozzáadása után 0,5—4 óra között, előnyösen a 2. órában történik. Közvetlenül ezután adjuk az induktor vírust (előnyösen tisztított vírust) a sejtszuszpenzióhoz. Ilyen módon is félig nyers (semi-crude) interferonhoz jutunk, melynek biológiai aktivitása megközelíti a nyers interferon aktivitását. A találmányunk tárgyát képező eljárás előnye, hogy a költséges és nehezen beszerezhető esszenciális aminosavak 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
