182209. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán leukocita interferon előállítására
5 182209 6 kiküszöbölésével, egyszerű és olcsó táp-oldat felhasználásával az ismert eljárásokkal készült nyers interferon titerét legalábbis elérő nyers interferon előállítását teszi lehetővé illetve félig nyers interferon külön tisztítási műveletek nélkül közvetlenül történő előállítására biztosít lehetőséget. A leírásban használt rövidítések jelentése a következő: Az ACD-oldat összetétele: nátrium-citrát 20,0 g; dextróz 30,0 g; citromsav, 5,1 g; desztillált víz 1000,0 ml-ig. Az ACD— AG-oldat ACD-oldatot, 700,0 mg guanozint, 500 mg adenin-szulfát-hidrátot tartalmaz. HA (hemagglutináló) egység meghatározása: a Sendai vírus a csirke vörösvérsejteket agglutinálja vagyis kicsapja. Az agglutinációt, mivel vörösvérsejtek agglutinációjáról van szó, hemagglutinációnak nevezzük. A hemagglutináció mértéke arányos a vírusanyagban jelenlévő vírusrészecskék számával, ezért a vírus mennyisége hemagglutinációval meghatározható és HA egységekben kifejezhető. A vírusanyag azon legkisebb mennyisége tartalmaz 1 HA egységet, amely adott térfogatú ismert koncentrációjú csirke vörösvérsejt szuszpenziót még maradéktalanul agglutinál. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákkal igazoljuk, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. 1. példa ACD-oIdatban (citromsavat és dextrózt tartalmazó oldat) vagy ACD-AG-oldatban (citromsavat, dextrózt, adenint és guanint tartalmazó oldat) felvett friss vagy + 4 °C-on legfeljebb 72 órán át tárolt emberi vér „buffy coat”-ját (fehérvérsejt) összegyűjtjük, egyesítjük és 0 °C-ra hűtjük. 1 térfogatrész fenti fehérvérsejt frakciót 5 térfogatrész 0,83%-os, + 5 °C-ra hűtött ammónium-klorid-oldattal elegyítünk és a vörösvérsejtek oldódásáig (kb. 5—10 perc) + 5 °C-on keverjük, majd a leukocitákat az elegyből centrifugálással nyerjük. Az ily módon izolált leukocitákat alábbi összetételű oldatban szuszpendáljuk: Komponens Koncentráció mg/1 kalcium-klorid 265 ferri-nitrát 0,1 kálium-klorid 400 magnézium-szulfát-heptahidrát 200 nátrium-klorid 6400 nátrium-hidrogén-karbonát 2750 nátrium-dihidrogén-foszfát-dihidrát 140 glükóz 4500 Az ily módon kapott szuszpenzióval az ammónium-kloridos kezelést megismételjük. A leukocitákat a fenti összetételű oldatban ismét szuszpendáljuk és a sejtszámot a fenti összetételű, azonban 5% emberi gamma globulin mentes szérumot és 25 mikrogramm/ml neomicint is tartalmazó oldattal 107/ml értékre állítjuk be. A sejtekhez 100 N.E./ml humán leukocita interferont adunk, majd előkezelés (priming) céljából 37 °C-on 2,5 órán át inkubáljuk. A sejtekhez ezután 100 hemagglutináló (HA) egység/ml Sendai vírust adunk és 37 °C-on 24 órán át inkubáljuk. A képződő szuszpenziót centrifugálásnak vetjük alá. A felül elhelyezkedő folyadék nyers interferont tartalmaz, 90 000 N.E./ml koncentrációban. összehasonlítás céljából a fenti eljárást azzal a változtatással végezzük, hogy tápoldatként az irodalomból ismert alábbi összetételű PBS-oldatot (Phosphate Buffered Saline) alkalmazzuk: Komponens Koncentráció mg/1 kalcium-klorid-dihidrát 132,5 kálium-klorid 200 kálium-dihidrogén-foszfát 200 magnézium -klorid-hexahidrát 100,0 nátrium-klorid 8000 dinátrium-hidrogén-foszfát 1150 A kapott nyers interferon hatóanyagtartalma mindössze 900 N.E./ml. 2. példa Az 1. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy a tápoldat ferri-nitrátot nem tartalmaz. A kapott nyers interferon hatóanyagtartalma 80 000 N.E./ml. 3. példa Az 1. példa szerint járunk el, azonban a vírussal 37 °C-on végzett inkubálást 15 perc után megszakítjuk, az előkezelt leukocitákat centrifugálással elválasztjuk, az 1. példában megadott összetételű, azonban 0,5% emberi gamma globulin mentes szérummal és 25 mikrogramm/ml neomicinnel kiegészített oldatban szuszpendáljuk, majd 16 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a sejteket és az egyéb ülepíthető anyagokat centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszó folyadékban az interferon specifikus aktivitása 120 000 NE/mg protein. A termék az ismert eljárásokkal készült nyers interferonokhoz viszonyítva lényegesen kevesebb szennyező fehéijét tartalmaz és tisztasága valamint hatóanyagtartalma alapján félig nyers (semi-crude) interferonnak tekinthető. 4. példa A 3. példa szerint járunk el, azonban a 0,5% gammaglobulin mentes szérumot tartalmazó tápoldattal az interferon előkezelés 2. órájában közvetlenül a tisztított vírus hozzáadása előtt végezzük a tápfolyadékcserét. A felülúszó folyadékban az interferon specifikus aktivitása 100 000 NE/mg protein. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás humán leukocita interferon előállítására a vér fehérvérsejtek ammónium-kloriddal történő kezelése, az így nyert leukociták tápoldatban történő szuszpendálása, interferonnal történő előkezelése, valamely interferon induktorral történő kezelése, majd az interferon tartalmú folyadéknak a sejtektől és egyéb ülepíthető anyagoktól történő elválasztása útján, azzal jellemezve, hogy 175—350 mg/1 kalci-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
