182171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoaciláz enzim elkülönítésére emlősök veséiből
182.171 képződött oldatból elkülönítjük a terméket, körülbelül 3000- "3G00 egység/rag fajlagos aktivitású enzimporhoz jutunk, amely további tisztítás nélkül közvetlenül felhasználható immobilizált aminoaciláz előállítására. Abban az esetben, ha az igy kapott enzimport kétlépéses kromatográfiás tisztításnak vetjük alá, körülbelül 15 000 egység/mg fajlagos aktivitású enzimkészitményhez jutunk. Ezzel az eljárással tehát, amely mindössze három elkülönítési és két tisztítási műveletből áll, rendkívül tiszta enzimkészitményt állíthatunk elő. Meglepő módon azt tapasztaltuk továbbá, hogy ezzel az eljárással olyan emlősvesékből /például szervasmarha-, ló- vagy nyulveséből/ is kiváló eredménnyel különíthetünk el nagy tisztaságú aminoacilázt, amelyek az enzimet lényegesen kisebb koncentrációban és több ballasztanyaggal szennyezve tartalmazzák, mint a sertésvese. A találmány tárgya tehát javított eljárás aminoaciláz enzim elkülönítésére emlősök veséiből. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy az önmagában ismert módon előállított vizes emlosvese-extraktumot 5_15 percig 60-80 C°-on hőkezeljük, a hőkezelt elegyet centrifugáljuk, a felüluszóhoz literenként 200- -300g K^A általános kepletü sót adunk - ahol K egyvegyértékü kationt jelent, A valamely szervetlen sav anionját jelenti, és x egyenlő az anion vegyértékével -, a kapott szuszpenziót centrifugáljuk, az elkülönített csapadékot vízben oldjuk és vízzel szemben dializáljuk, majd kívánt esetben a dializált oldatot, illetve az oldatból elkülönített enzim 6,5 és 8,5 közötti pH-értékü pufferoldatta1 készített oldatát anioncserés kromatográfiának vetjük alá, végül kívánt esetben az anioncserés kromatográfia során kapott aktiv frakciókat, illetve az aktiv frakciókból K^A általános képletü sóval végzett kicsapással elkülönített enzim 6.0 és 8,0 közötti pH-értékü pufferoldattal készített oldatát gélkromatográfiának vetjük alá egy olyan gélszürőn ahol a frakcionálási molekulaszly-tartomány felső határa 70 000- nél nagyobb érték, és a terméket a fent ismertetett módon valamely KxA általános képletü sóval kicsapjuk az aktiv frakciókbóL A találmány szerinti eljárás első műveleti lépésében a vizes emlősvese-extraktumot 5-15 percig 60-80 C°-on /előnyösen 10 percig 70 C°-on/ hőkezeljük. Ezzel a hőkezelési művelettel az elkülönítendő enzimet kisérő fehérjék legnagyobb részét denaturáljuk. A denaturált fehérje nagyfelületű csapadék formájában válik ki a vizes oldatból, és derítő hatása révén az ol.i datban maradt szennyezőanyagok nagy részét is magával ragadja. Ezzel a ténnyel magyarázható, hogy a találmány szerinti eljárással* már az első három elkülönítési művelettel /hőkezelés, kicsapás, dializálás/ megközelíthetjük azt a tisztítási hatásfokot, amely a J. Biol. Chem. 194. 455 /1952/ közleményben ismertetett módszer szerint csak hat elkülönítési művelettel érhető el. A denaturált fehérje elkülönítése után kapott vizes oldatból 200-300 g/l? előnyösen 250-280 g/1, célszerűen 260-270 g/1 Ky.A általános kepletü sóval kicsapjuk a nyers enzimtartalmu terméket. K^A általános képletü sóként célszerűen emmóniumszulfátot használunk fel, azonban egyéb sókat, igy például nátriumkloridot vagy ammóniumkloridot is alkalmazhatunk. A kivált csapadékot vízben oldjuk, és a vizes oldatot önmagában ismert módon vízzel szemben dializáljuk. A dializált oldatból kívánt esetben önmagukban ismert mód* szerekkel, plédául liofilizálássel, porlasztva szárítással jvagy 3
