182171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoaciláz enzim elkülönítésére emlősök veséiből
182.171 bepárlássál elkülöníthetjük az enzimtartalmu terméket. Az igy kapott enzimtartalmu termék 37 C°-on mért aktivitása 3000-3600 egység/mg, ami körülbelül 20-25-szörös tisztitási hatásfoknak felel meg. Ez a termék további tisztitás nélkül közvetlenül felhasználható például immobilizált enzimkészitmények előállításához. Amennyiben a fentiek szerint kapott nyers terméket tovább kívánjuk tisztítani, a szilárd enzimtartalmu anyagot nem szükséges feltétlenül elkülönítenünk a dializált oldatból. A dializált oldatot - adott esetben a pH beállítása után - közvetlenül felvihetjük az anioncserélő oszlopra. Anioncserélő anyagként előnyösen Sephadex kereskedelmi nevű gyantákat, például DEAE-Sephadex A-50-et használhatunk fel. Ha az ioncserés kromatográfia során szilárd enzimtartalmu anyagból indulunk ki,ezt az anyagot pufferoldatban /például 0,05 mólos káliumfoszfát-pufferoldatban /pH = 7»0// oldva visszük fel a gyantaoszlopra. A gyantaoszlopot ugyanezzel a pufferoldattal hozzuk egyensúlyba egy előzetes műveletben. A gyantaoszlopot előnyösen nátriumkloridot /célszerűen 0,3 mól nátriumkloridot/ tartalmazó 0.05 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal /pH = 7>0/ eluáljuk, elualószerként azonban más, megfelelő ionerősségü sóoldatot is felhasználhatunk. Az anioncserélő oszlopot elhagyó aktiv frakciókat egyesitjük, majd az aktiv frakciókból kivánt esetben a fent ismertetett kicsapásos művelettel elkülönítjük az enzimtartalmu terméket. A kicsapáshoz 1 liter oldatra vonatkoztatva rendszerint 200-300 g, előnyösen 250-280 g, célszerűen 260-270 g K^A általános képletü sót /előnyösen ammóniumszulfátot/ használunk fel. Az elkülönített termék 37 C°-on meghatározott fajlagos aktivitása 6000-6600 egység/mg, ami a kiindulási extraktumhoz viszo- ' nyitva körülbelül 40-45-szörös tisztitási hatásfoknak felel meg. Amennyiben az enzimtartalmu terméket tovább kívánjuk tisztítani, a szilárd enzimtartalmu anyagot nem szükséges feltétlenül elkülönítenünk az anioncserélő oszlopot elhagyó aktiv frakcióból, hanem az aktiv frakciókat - adott esetben a pH megfelelő beállítása után - közvetlenül felvihetjük a géloszlopra. A gélkromatográfiás művelethez előnyösen Sephadex kereskedelmi nevű géleket, például Sephadex G-200-at használunk fel. E tisztítási műveletben csak olyan géleket alkalmazhatunk, amelyek frakcionálási molekulasuly-Éartományának felső határa 70 000- nél nagyobb érték. Ha a gélkromatográfia során szilárd enzimtartalmu anyagból indulunk ki, ezt az anyagot pufferoldatban /például 0,05 mólos káliumfoszfát-pufferoldatban /pH = 7»0/ oldva visszük fel a géloszlopra. A géloszlopot előzetesen ugyanezzel a pufferoldattal egyensúlyba hozzuk. A géloszlopot célszerűen 0,05 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal ./pH = 7,0/ eluáljuk, eluálószerként azonban más hig pufferoldatokát is felhasználhatunk. A géloszlopot elhagyó aktiv frakciókat egyesitjük, majd az aktiv frakciókból a korábbiakban ismertetett kicsapásog módszerrel elkülönítjük az enzimtartalmu terméket. A kicsapáshoz 1 liter oldatra vonatkoztatva rendszerint 200-300 g, előnyösen 250-280 g, célszerűen 260-270 g KA általános képletü sót A /előnyösen ammóniumszulfátot/ használunk fel. Az elkülönített termék 37°-on meghatározott fajlagos aktivitása 15 000 egység/ /mg körüli érték, a termék tisztasági foka tehát kiváló. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 4
