182171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoaciláz enzim elkülönítésére emlősök veséiből
182.171 A találmány tárgya javított eljárás amlnoaciláz enzim elkülönítésére emlősök /elsősorban sertések/ veséiből. Ismert, hogy az aminoaciláz enzim a sertésvesékben fordul elő a legnagyobb koncentrációban; igy az aminoaciláz elkülönítésére alkalmazott ismert módszerek szerint kiindulási anyagként sertésvesét használnak fel. A J. Biol. Chem. 178, 503 /1949/ közlemény szerint az ami-* poaciláz elkülönítése során a sertésvese-kéreg vizes extraktu-Íát 78 %-os etanollal 15 %-os etanolkoncentráció eléréséig te-' itik, az elegyet 12 órán át -6 C“-on állni hagyják, majd cent-* rifugálják, és a felüluszót etanollal 30 %-ra telitik. Az elegy pH-ját 6,3-ra állítják, majd -15 C°-on újabb 12 órán át állni hagyják. A csapadékot centrifugálással eltávolítják, a felüluszó pH-ját 5,1-re állítják, és az elegyet újabb 12 órán át állni hagyják. A kivált csapadékot - amely az aminoacilázt tartalmazza — centrifugálássál különítik el. Az igy kapott termék fajlagos aktivitása körülbelül négyszerese a kiindulási extraktuménak, ami igen csekély tisztítási hatásfoknak felel meg. A J. Bioi. Chem. 194, 455 /1952/ közlemény hat frakcionálási lépésből és azt követö liofilizálásból álló műveletsort ismertet aminoaciláz elkülönítésére sertésvese vizes extraktumából. Ez az eljárás körülbelül 30-szoros /tehát még mindig viszonylag csekély/ tisztítási hatásfokkal szolgáltatja az aminoacilázt, és az előzőekben ismertetett módszernél lényegesen munkaigényesebb. A liofilizált termék fajlagos aktivitása mindösz** Sze 4640 egység/mg. A Biochem. Z. 536, 162 /1962/ szakcikkben ismertetett eljárással igen tiszta /15 686 egység/mg fajlagos aktivitású/ aminoacilázt lehet elkülöníteni sertésvese vizes extraktumából. Az eljárás hátránya azonban az, hogy kilenc hosszadalmas, idő- és munkaigényes elkülönítési és tisztítási műveletet igényel. : A Biochimija 22, 838 /1957/ közleményben ismertetett eljárásban kiindulási anyagként sertésveséből készített acetonport használnak fel. Az acetonport foszfátpufferrel extrahálják, az extraktumot két lépésben ammóniumszulfáttal telitik, és a kapott ezuszpenziót dializálják. A dializis után kapott oldatot 5 percig 60 C°-on hőkezelik, majd két lépésben telitett ammóniumszulr fát-oldattal frakciónálják. A képződött csapadék vizes oldatát ismét dializálják, majd az oldatot kétlépéses acetonos frakcióhálásnak vetik alá. Az utolsó frakcionálási lépésben kapott csa,|>adékot vizben oldják, az oldatot desztillált vízzel szemben dializálják, végül fagyasztva szárítják. Ezzel az eljárássál,amely 12 műveleti lépésből áll, körülbelül 15 000 egység/mg aktivitású termék állítható elő. I Az ismert eljárások közös hátránya tehát az, hogy az aminos aciláz.t gyenge vagy közepes tisztítási hatásfokkal szolgáltatják, és megfelelően tiszta termék csak bonyolult /9-12 tisztítási lépésből álló/ műveletsorral állítható elő. bA találmány értelmében az ismert módszerek e hátrányait kir szöbölve olyan eljárást kívánunk biztosítani aminoaciláz ellönitésére, amely kisszámú, egyszerűen végrehajtható műveleti lépést igényel, és nagy fajlagos aktivátásu terméket szolgáltat^ I Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy ha a sertésvesè tizes extraktumát hőkezeljük, centrifugáljuk, a felüluszót valamely egyértékü kation szervetlen savval képezett sójával telítjük, a kapott szuszpenzióból elkülönítjük a csapadékot, majd a csapadék vizes oldatát vízzel szemben dializáljuk, és az ig^ 2
