182005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens alfa-amiláz meghatározására
182.005 A nitrocsoportokat tartalmazó szubsztituensek iehasitása-*kor szabaddá- váló nitro-fenolok illetve dinitro-fenoíok maguk színes vegyületek. amelyek minden további nélkül optikailag meghatározhatók. Amennyiben fenol maga hasad le, úgy ez ismert módszerek szerint, például valamilyen nukleofll ágenssal, igy 3~metil-6~azulfqnil-benztíazolon-2-hidrazonnal /HSK/ monofenoloxidáz jelenlétében végzett reakcióval határozható meg. Ennél a reakciónál vörös színezék képződik, amely mérhető. Szorbit lehaaitásakor ez például szórbit-dehidrogenázzal fruktózzá oxidálható*, egyidejűleg a jelenlévő HAD HADH-vá re-_ dukálódik. Az utóbbi képződése ismert módon ultraibolya spektrofotométerben könnyen meghatározható. Ha ilyen nem áll rendelke-l Se, úgy valamilyen tetrazólium-aóvai, igy például INT-vei p-jód-fenil/-3-/p-nitro-fenil/-5-fenil-tetra-zóllum-kioriddiaforáz vagy valamilyen más elektronátvivő jelenlétében „áltatva is színes formazán képződik, amely látható tartományban mérhető. Hasonló módon határozható meg a felszabaduló glükonsav az itt ismertetett módszerek szerint, például glükonát-kinázzal, 6-foszfo-glükonsav-dehidrogenázzal és IÍÁDP-vel, valamint adott esetben tétrázóliurna óval és elektronátvivővel. A találmány szerinti eljárás kivitelezéséhez általában 5 és 9 közötti pH-értékek megfelelők. Előnyösen 7 és 7»5 közötti, pH-értéken dolgozunk, mivel itt érjük el a legjobb eredményeket es a legrövidebb reakcióidőt. Amennyiben a találmány szerint nltro-feni1-vegyUleteket használunk, úgy a megfelelő pH-értékek tartománya valamivel szükebb, és általában 6 és 8,5 pH közé esik. Pufféiként olyanok felelnek meg, amelyek az alkalmazott enzimekjő aktivitási tartományában működnek. Előnyös a foszfát, 1IEPES rN-/2-hidroxi~etil/-pipeiazin~N-2~etánszulfonsavl és glioil-glicln. Előnyös koncentráció a 10 és 200 mmól/liter közötti. Az oC-glükozidázt általábar 0,1 és 5000 egység/ml közötti mennyiségben használjuk. A találmány szerinti eljárás különös előnye, hogy ezen enzim viszonylag nagy mennyiségei alkalmazhatók, úgy hogy a sebess égmeghatáxozó lépés az oC-ami lázhas it ás . Természetesen lehetséges az is, hogy ebből az enzimből még nagyobb mennyiségeket használjunk, ezzel azonban már semmilyen további előnyt nem érünk el. A találmány szerint alkalmazott I általános képletü vegyületeket a vizsgálatban általában 0,1 és 250 mmól/liter közötti mennyiségben használjuk. Előnyös a 0,5 és 100 mmól/liter közötti mennyiség. Az (%-amiláz maltoheptaózzal való szubsztráttelitődése 8-10 mmól/liter koncentrációnál van. Ezért célszerűen legalább 8 mmól maltoheptaóz minimális koncentrációt alkalmazunk, mivel a szubsztráttelitettség körülményei között kell dolgozni, ami rendszerint fennáll. Ezenkívül célszerűen az ami lázhoz még valamilyen aktiválószert is hozzáadunk. Ilyenfajta aktiválószerek ismertek. E- lőnyös nátrium-klorid vagy kálium-klorid. A találmány szerinti eljárás egy további előnyös kivitelezési formájánál a hasítási termékek meghatározása maltóz-fosfeforilázzal végzett reagáltatással történik glükóz-l-foszfát keletkezése közben, amelyet azután önmagában ismert módon határozunk meg. Egy különösen előnyös kiviteli forma szerint a glükóz-1-foszfát meghatározása fl-foszfo-glukomutázzal glükoz-6-foaz-4
