181993. lajstromszámú szabadalom • Eljárás legyengített peritonítisz vírus-törzs előállítására
5 181993 6 határozza meg az egyes passzázsok inkubálási idejét, amely 1 naptól 5 napig terjedhet. Az egyes passzázsokból kapott vírusok titere 104,0 TCID50/ml és 10lo,ü TCID50/ml között változhat. TCID50 a sejt-kultúrának azt a fertőző adagját jelenti, amely a vírus-fertőzésnek kitett kultúra sejtjeinek 50%-án okoz citopátiás hatást. Körülbelül 100 passzázs után a fertőző macska-hashártyagyulladás-vírus már legyengítettnek tekinthető, minthogy ebben az állapotában a vírus szérum-semlegesítő antitestek termelését váltja ki a fertőzésre hajlamos állapotban, anélkül azonban, hogy számottevő mellékhatások vagy nyilvánvaló betegség-tünetek lépnének fel. Az ilyen módon legyengített fertőző macska-hashártyagyulladás-vírus mintáinak nagyüzemi termelése céljából a rendszerint törzs-vírusként tárolt vírust frissen készített macska-embrió sejt-kultúrán tenyésztjük valamely erre alkalmas közegben, például szérum-mentes Eagle-féle „Minimum Essential Medium” vagy „199 Maintenance Medium” közegben. Ha 1—5 napi inkubálás után már csaknem teljes citopátiás hatás mutatkozik, akkor a sejteket és a közeget összegyűjtjük. Az így termelt vírus valamennyi adagját vizsgálni kell sterilitás-hatóképesség, toxikusság és hasonló gyakorlati tulajdonságok szempontjából; az ilyen vizsgálatokat a British Pharmacopoeia (Veterinary) 1977 (Brit állatgyógyászati gyógyszerkönyv, 1977) 149. oldalán ismertetett irányelvek szerint végezzük. A kapott vírus-szuszpenziót azután célszerűen ampullákban vagy üvegcsékben megfagyasztjuk és cseppfolyós nitrogénben tároljuk. Adhatunk azonban a vírus-szuszpenzióhoz stabilizálószereket, például szorbitot és/vagy fehérje-hidrolizátumokat (például a „Sol-U-pro” készítményt) is és az így stabilizált vírus-készítményt liofilizált állapotban tárolhatjuk. A találmány egyik további tárgyát tehát oly vakcina előállítása képezi, amely immunitást fejleszt ki az állatokban a fertőző macska-hashártyagyulladással szemben; a találmány szerinti vakcina egy a fentebb adott meghatározásnak megfelelő legyengített macska-hashártyagyulladás-vírust tartalmaz hatásos adagban vagy ennek többszörösében, gyógyászati szempontból elfogadható hordozó kíséretében. A vakcinálás szempontjából hatásos adag 104,0—108’0 TCID50/ml, előnyösen IO5’0—107’0 TCID50/ml lehet. A vakcina gyógyászati szempontból elfogadható hordozója valamely folyadék lehet; alkalmas erre a célra például az olyan vizej oldat, amely tápanyagokat és stabilizálószereket tartalmaz ; ilyen például a Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldat vagy más hasonló közegek. A hordozó egyes esetekben egy lezárt steril edény, például ampulla vagy üvegcse is lehet. A találmány szerinti vakcinát intraperitoneális, szubkután vagy intramuszkuláris injekcióban, vagy pedig orális, nazális vagy intraokuláris úton adhatjuk be a macska-fajtájú állatoknak. A kívánt adag-mennyiséget egy adagban, vagy időben elosztva, több kisebb adagban adhatjuk be. Előnyösen úgy járunk el, hogy a legyengített macska-hashártyagyulladás-virus hatásos mennyiségét tartalmazó, 1—2 ml térfogatú készítményt egyetlen adagban adjuk be az állatnak. A találmány szerint előállított vakcina a legyengített fertőző macska-hashártyagyulladás-víras mellett tartalmazhat egyéb, más mikroorganizmusokból származó antigén anyagokat is ; az ilyen kombinált vakcinákban a macska-fajtájú állatok más kórokozó vírusaiként például parvovírusokból, mint fertőző macska-bélgyulladást (macska-panleucopenia), macska-veszettséget, leukémiát, macska-herpest okozó vírusokból, továbbá macska-calcivírusból, retrovírusból és hasonlókból nyert antigén anyagokat alkalmazhatunk előnyösen. Különösen előnyös kombináció az olyan nedves készítmény, amely egy steril edényben legyengített macska-hashártyagyulladás-vírust és egy további edényben liofilizált száraz készítmény alakjában egy vagy több további macska-vakcinát tartalmaz; az ilyen kombinált készítmény alkalmas arra, hogy felhasználás előtt a készítmény két komponensét egyesítsük és ebben az alakban alkalmazzuk. A találmány szerinti legyengített macska-hashártyagyulladás-vírust liofilozált alakban is alkalmazhatjuk, amikoris a készítmény másik alkotórészét képező vakcina folyékony alakban van. További lehetőségként a legyengített FIP-vírust liofilizált alakban alkalmazzuk a készítményben egy- vagy többfajta fentebb említett másféle vakcinával kombináltan és a készítményhez egy steril vizet tartalmazó edényt is csomagolunk, amelynek tartalmával a liofilizált vakcinát alkalmazás előtt rekonstituálhatjuk, vagyis beadásra alkalmas alakba hozhatjuk. Az említett edényeket egy közös dobozba vagy tartályba csomagoljuk, megfelelő használati utasítással együtt, amelyben leírjuk a liofilizált vakcinának a nedves készítménnyel vagy steril vízzel történő rekonstituálását felhasználás előtt. A találmány további tárgyát egy oly módszer képezi, amellyel a macskaféle állatokat immunissá tehetjük a fertőző hashártyagyulladással szemben; e módszer lényege az, hogy az állatoknak a fentebb leírt vakcina hatásos adagját adjuk be. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik ; megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre semmilyen szempontból nincsen e konkrét példák tartalmára korlátozva. 1. példa Fertőzött macska peritoneális folyadékából származó FlP-vírus elkülönítése és sorozatos átoltásokkal történő tenyésztése Egy fertőző hashártyagyulladásban elhullott 3—4 hónapos macska peritoneális folyadékát pipettával, aszeptikus körülmények között kivesszük és diploid macskaembric-tüdősejtek összefolyó egysejt-rétegét tartalmazó sejt-készítményre oltjuk. Beoltás előtt az egysejt-rétegeket foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldattal kétszer mossuk, majd szérummentes „199” fenntartó tápközeggel tápláljuk a sejteket. A fertőzött egysejt-rétegeket 37 °C hőmérsékleten körülbelül 7 napig inkubáltatjuk, majd megfagyasztás és újbóli feleresztés útján összegyűjtjük a vírust. Az így szétroncsolt fertőzött sejteket tartalmazó közeg egy alikvot részét diploid macska-embrió-tüdősejtek friss egysejt-rétegeit tartalmazó, „199” közegben fenntartott kultúrájára oltjuk és 37 °C hőmérsékleten inkubáltatjuk. A vírust azután hasonló módon 3—5 sorozatos paszszázson visszük át, míg a jellegzetes citopátiás hatás nem kezd mutatkozni, ami azt jelenti, hogy a fertőzött sejtek előbb szabálytalan alakokat kezdenek mutatni, majd 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
