181993. lajstromszámú szabadalom • Eljárás legyengített peritonítisz vírus-törzs előállítására
7 181993 8 y y végül kerek alakot öltenek, ami a nedves készítmény mikroszkópos vizsgálatával figyelhető meg. Az 5. paszszázstól kezdődően a citopátiás hatás már igen határozottan mutatkozik és rövid idő alatt, 48—72 órán belül szétroncsolja a sejtréteget. Az így kapott vírust azután 100 sorozatos passzázson visszük keresztül, amikoris a vírus 104,0—108,0 TCID50/ /ml titert mutat. 2. példa A fertőzött macska májából kapott FIP-vírus elkülönítése és sorozatos átoltásokkal történő tenyésztése Egy fertőző hashártyagyulladásban elhullott 11 hónapos macska máját kivesszük és a máj-szövetet egy „Stomacher 80 (Colworth)” szövet-dezintegrátorban 60 másodpercig trituráljuk foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldattal. A kapott szuszpenziót ezután 1108 g-vel centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot dekantáljuk és ráoltjuk egy heteroploid macskaembrió-tüdősejtek összefolyó egysejt-rétegét szérummentes „199” közegben tartalmazó sejt-készítményre. A vírust ezután az 1. példában leírt módon elkülönítjük és sorozatos passzázsokon visszük keresztül, aminek során a készítmény az előző példában leírttal azonos módon mutatja a citopátiás hatást az egyes passzázsokban. 3. példa ......... A fertőző hashártyagyulladás akut stádiumában levő fertőzött macska véréből származó FIP-vírus elkülönítése és sorozatos átoltásokkal történő tenyésztése Egy fertőző hashártyagyulladásban szenvedő 6 hónapos macskától (a betegséget lázas állapot és a szervezet leromlása alapján diagnosztizálhatjuk) vért veszünk a juguláris vénából. A vért 20 percig állni hagyjuk, hogy megalvadjon. A szérumot és a plazmát elkülönítjük az alvadékból, majd az alvadékot egy „Stomacher” szövet-dezintegrátorban 60 másodpercig trituráljuk foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldatban. A kapott szuszpenziót azután 1108 g-vel centrifugáljuk, a szupernatáns folyadékot dekantálással elkülönítjük és az így kapott folyadékkal diploid macska-embrió-tüdősejtek összefolyó egysejtrétegeit szérum-mentes „199” közegben tartalmazó sejtkultúrát oltunk be, majd a beoltott sejt-kultúrát 5—8 napig inkubáltatjuk 37 °C hőmérsékleten. A vírust azután az 1. példában leírt módon elkülönítjük és sorozatos passzázsokon visszük keresztül ; a leírt citopátiás hatást tapasztaljuk az egyes passzázsokban. 4. példa A 2. példa szerint kapott vírust egy az 1 286 250 sz. brit szabadalmi leírásban ismertetett módon készített heteroploid macska-embrió-tüdősejtvonalon passzázsoltatjuk. (Heteroploid sejtvonalat akkor kapunk, ha a sejteket a primer kultúrából kiindulva legalább 70-szer sikeresen passzázsoltatjuk.) A fenti művelet során ugyanolyan citopátiás hatást tapasztalunk a megfelelő passzázsokban, mint az 1. példában leírt eljárás során. Az így kapott vírus titere ezúttal is 104,0 TCID30/ml és 10lo'° TCID50/ml között van. 5. példa Az 1. példában leírt módon történő sorozatos átoltások után a 100. passzázsból kapott sejteket megfagyasztjul és újból föleresztjük a legyengített FÍP-vakcina kinyerése céljából. Az így kapott vakcinát olyan 12 hetes macskáknak adjuk be, amelyek az előzetes vizsgálat során a fertőző hashártyagyulladás antitestjeiből menteseknek bizonyultak. A beadást intraperitoneális injekcióval végezzük, egyetlen, IO6 TCID50/ml vírustiterű 2 ml-es adaggal. 21 nap múlva a macskákból vért veszünk es a szérumot megvizsgáljuk, hogy tartalmaz-e semlegesítő antitesteket. Azt találjuk, hogy a szérumban már szignifikáns mennyiségű semlegesítő antitest van jelen, amint ezt az alábbi titer-értékek mutatják : antitest-titer vakcinálás előtt : kisebb mint 10, antitest-titer vakcinálás után: 160. 6. példa Egy a macskaféle állatok fertőző hashártyagyulladás, fertőző bélgyulladás és vírusos rhinotracheitis elleni immunizálására alkalmas vakcina-készítmény a következő alkotórészekből áll : egy ampulla, amely liofilizált élő legyengített, fertőző bélgyulladás elleni vakcinát és élő módosított, vírusos rhinotracheitis elleni vakcinát tartalmaz, továbbá egy második ampulla, amely az 1. példa szerint előállított inaktivált FlP-vírus-szuszpenziót tartalmaz, továbbá használati utasítás beadásra kész készítménynek a liofilizált vakcinából, a folyékony készítmény felhasználásával történő előállítására. 7. példa A macskaféle állatok fertőző hashártyagyulladás, fertőző bélgyulladás és veszettség elleni immunizálására alkalmas vakcina-készítmény a következő alkotórészekből áll : egy ampulla, amely liofilizált élő, legyengített, fertőző hashártyagyulladás elleni vakcitinát (amelyet az 1. példában leírt módon állítottunk elő) és ugyancsak liofilizált fertőző bélgyulladás elleni élő, legyengített vakcinát tartalmaz, továbbá egy második ampulla, amely veszettség elleni inaktivált vírus szuszpenzióját tartalmazza, végül egy használati utasítás a liofilizált vakcinának a folyékony szuszpenzió felhasználásával beadásra kész készítménnyé való alakítására. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás a macskafélék fertőző hashártyagyulladását okozó vírus (feline infections peritonitis, rövidítve : FIP) legyengített törzsének előállítására (amely 80— 160 mm átmérőjű, lényegileg gömbalakú, körülbelül 25 mm hosszúságú kiálló nyúlványokkal rendelkezik, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
