181993. lajstromszámú szabadalom • Eljárás legyengített peritonítisz vírus-törzs előállítására
3 181993 4 rusa legyengített állapotban 48—72 óra alatt teljesen elroncsolja az egyréteges sejtkultúrát. A jelen találmány szerint tehát a macskafélék fertőző hashártyagyulladása vírusának olyan legyengített törzsét állítjuk elő, amely antitestek fejlődését váltja ki a fertőzésre hajlamos állatokban, anélkül hogy a fertőző hashártyagyulladás jellemző tüneteinek fellépését eredményezné, amely továbbá morfológiailag hasonló a coronavírusokra, különösen a fertőző madár-bronchitis kórokozó vírusára, de ez utóbbitól fejlődési tulajdonságaiban különbözik annyiban, hogy emlős szövetkultúrán fejlődni képes, embrionált tojásban azonban nem fejlődik és amely a szövetkultúra sejtjeinek megfertőzése esetén jellegzetes citopátiás hatást okoz, amelyben a sejtek a mikroszkópos vizsgálat során szabálytalan alakot mutatnak nedves készítményekben, végül azonban kigömbölyödnek és/vagy elválnak attól a szilárd felülettől, amelyen fejlődtek. A coronavírusok osztályába tartozó vírusok lényegileg gömbalakúak, 80—160 nm átmérővel, körülbelül 25 nm hosszúságú kiálló nyúlványokkal, amelyek oly külső megjelenést adnak a vírusnak, mintha azt fénykoszorú vagy korona Övezné. Az ilyen legyengített fertőző macska-hashártyagyulladás-vírusok törzseinek előállítása oly módon történik, hogy valamely virulens fertőző macska-hashártyagyulladás-vírust elkülönítünk és macska-embrió sejt-kultúrákban sorozatos passzázsokon (átoltásokon) visszük át körülbelül 100 alkalommal, hogy ezáltal a vírus patogén tulajdonsága csökkenjen, fertőzőképességét és immunogenitását azonban megtartsa. Macska-embrió sejtkultúrájaként bármely macska-fajtájú állat embrióiból nyert sejtvonal vagy sejt-törzs alkalmazható. A találmány további tárgyát oly eljárás képezi a fertőző macska-hashártyagyulladás virulens vírusainak legyengítésére, amelynek során valamely elkülönített níacska-hashártyagyulladás-vírust macska-embrió sejtkultúrákban sorozatos passzázsokon viszünk keresztül körülbelül 1Ö0 alkalommal és adott esetben az így kapott legyengített vírust valamely erre alkalmas sejtkultúrában tenyésztjük, hogy vakcina előállítására elegendő mennyiségű vírust kapjunk. A fertőző macska-hashártyagyulladás virulens vírusának az elkülönítése az említett betegségben szenvedő macska peritoneális folyadékából, véréből, vizeletéből vagy különféle szerveiből történhet. Peritoneális folyadék vagy vizelet e célra való alkalmazása esetén az eljárás céljaira választott sejt-kultúrákat közvetlenül beolthatjuk a fertőző vírust tartalmazó folyadékkal. A vírusnak a fertőzött állat véréből történő elkülönítése céljából az állatot a juguláris vénából vagy bármely más alkalmas vénából véreztetjük; az így kivett vérmintát megalvadni hagyjuk, az alvadékot például mozsárban eldörzsöljük és valamely erre alkalmas közegben, például foszfáttal pufferezett sóoldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót azután centrifugáljuk a durva szövettörmelékek eltávolítása céljából, a szupernatáns folyadékot elkülönítjük és ezt használjuk fel a sejt-kultúrák beoltására. Kinyerhetők a vírusok a fertőzött macska vagy egyéb macska-fajtájú állat más szerveiből, például a májból, lépből vagy csepleszből (omentumból) is ; a sejt-kultúrák beoltására szolgáló vírus-készítmény előállítása ebben az esetben is lényegileg úgy történik, amint ezt a megalvadt vér esetében leírtuk, tehát a szervet eldörzsöljük, alkalmas közegben szuszpendáljuk, a szuszpenziót centrifugáljuk és a szupernatáns folyadékot alkalmazzuk a sejt-kultúrák beoltására. A virulens vírusok sorozatos passzázsának végrehajtására alkalmas macska-embrió sejt-kultúrákat a macskafélék fajához tartozó bármely állat embriójának tüdejéből, veséjéből, szívéből, májából, beléből vagy más alkalmas szervéből vagy ilyen szervek keverékéből vehetjük; alkalmas szövetek nyerhetők erre a célra_a bőrből, izmokból, placentából vagy a nyelvből is. A sejt-kultúráknak a macska-embrió különböző részeiből, vagy akár az egész embrióból történő előállítása olyan_módszerekkel történhet, amilyeneket az 1 177 625 és 1 286 250 sz. brit szabadalmi leírások, valamint a J. Hygiene, 67, (1969), 115—124. közlemény ismertetnek. Az idézett szabadalmi leírások a diploid sejt-törzsek előállítására alkalmas eljárást ismertetnek, míg az utóbb idézett közlemény heteroploid sejtvonalak előállítására szolgáló eljárást íi le. A módszerek lényege az, hogy az embriót vagy annak az e célra választott részét mechanikai vagy enzimes úton felaprítjuk, a kapott sejt-szuszpenziót valamely a sejt-kultúra tenyésztésére szolgáló közeget magába fogadó edénybe visszük és 32—39 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A szubkultúra-tenyésztés megkönnyítésére célszerű az egybefolyó sejt-lapokat tripszinnel vagy valamely ártalmatlan kelátképző anyaggal kezelni az újabb friss közegbe történő átvitel előtt. Alkalmazhatunk azonban a fertőző macska-hashártyagyulladásvírus tenyésztésére primer macska-sejtkultúrákat is ; ezek előállítási módja a szakmabeliek számára jól ismert és bármely virológiái kézikönyvben megtalálható. Az elkülönített virulens fertőző macska-hashártya gyulladás vírus tenyésztése oly módon történhet, hogy az e célra választott macska-embrió sejtek egysejt-rétegét vagy sejt-lapját beoltjuk a fertőzött állatból származó vírus-készítménnyel, majd a beoltott sejt-kultúrát 35 ~C és 39 °C közötti, előnyösen 37 °C hőmérsékleten 3—10 napig, előnyösen 5—8 napig inkubáljuk valamely erre alkalmas közeg jelenlétében. Közegként célszerűen valamely kémiailag definiált anyagot alkalmazunk biológiai adalékok, például szérum hozzáadása nélkül. Ilyen célra alkalmas közegek példáiként az Eagle-féle alap-közeg [Eagle H., Science, 130, 432 (1959)] vagy a „199” fenntartó-közeg [Morgan J. F. és munkatársai, Proc. Soc. Exp. Biol. (N. Y.), 73 1 (1950)] említhetők. A közeghez adhatunk valamely baktériumellenes szert, például penicillint és/vagy sztreptomicint is. Az inkubálás befejezése után a vírust mechanikai módszerekkel, például fagyasztással és felolvasztással k ülöníthetjük el ; az így kapott vírus-készítményt azután a szokásos szövetkultúra-módszerekkel (vö. : A Manual of Basic Virological Techniques, G. C. Rovozzo és C. N. Burk, Prentice-Hall Inc., Eaglewood Cliffs, N. J., USA, 1973) alkalmazzuk a macska-embrió sejtek cgysejt-rétegű kultúráinak sorozatos passzázsolására. A vírus első néhány, rendszerint körülbelül 5 passzázsa során nem tapasztalható nyilvánvaló citopátiás hatás a sejteken. Az ezután következő további passzázsokban azonban a fertőző macska-hashártyagyulladás-vírussal történő fertőzés a fentebb ismertetett jellemző citopátiás hatásokat idézi elő az egyrétegű sejt-kultúrákon; ez a hatás körülbelül 48—72 órai inkubálás után mutatkozik. A sejtek végülis elválnak a tenyésztő-edény felületéről. A nyilvánvaló citopátiás hatás megjelenése 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
