181957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló fehérje jellegű antigén preparátumok előállítására
5 181957 6 Az alábbiakban példákkal szemléltetjük a találmány szerinti jellegzetes eljárásokat és készítményeket. Az 1. ábra az immunizált („a” görbe) és a kontroll („b” görbe) állatok antigén A-val kiváltott IgG válaszait mutatja. A 2. ábra az antigén A által kiváltott IgG válaszokat mutatja egyetlen állat esetében. 1. példa NDS-sel extrahált sejtfalak antiszérumának előállítása A jól ismert Ingbritt Streptococcus mutáns törzset használjuk. A törzs leírása megtalálható Krasse, B.: Archs. Oral Biok, 11, 429—436, és Coykendal rendszere szerint az I genetikus csoportba (J. Gen. Microbiol., 83, 327—338, [1974]), Bratthall osztályozása szerint pedig a „c” szerotípusba (Ódont. Revy, 20, 231—243, [1969]) tartozik. A törzs deponálva van az NCIB-nél, Aberdeen-ben, Skóciában, az NCIB 11 516 deponálási számon. A baktériumokat Todd-Hewitt táptalajon tenyésztjük (Todd, E. W., Hewitt, L. F.: J. Path, and BacterioL, 35, 973—974, [1932]), a stacionárius fázis eléréséig (16 óra). Ezután a sejteket centrifugálással kinyerjük és forró vízfürdőn 20 percig szuszpendáljuk nátrium-dodecil-szulfát (NDS) szolubilizáló puíferben (Laemmli: Nature, 227, 680—685, [1970]). Ezután a sejteket centrifugálva vízzel mossuk, fagyasztva szárítjuk és vízzel 10 mg/ml koncentrációjú szuszpenziót készítünk belőlük. Ezekkel az NDS-sel extrahált sejtekkel nyulat immunizálunk úgy, hogy a szuszpenzió 1 ml-ét 0,1 ml alumínium-hidroxid adjuvánssal keverjük. Ilyen keveréket adunk be a nyúlnak intramuszkulárisan a nulladik, huszonegyedik és negyvennyolcadik napon. Az ötvenötödik napon a nyulat szívpunkcióval elvéreztetjük. Hasonló eredményt kapunk akkor is, ha a sejteket NDS 10 g/1 koncentrációjú vizes oldatával extraháljuk forralva 20 percig vagy szobahőmérsékleten 1 óra hosszat. 2. példa Az antigén A és antigén B jellemzése Az 1. példában leírt módon előállított antiszérum hatását immunodiffúziós módszerrel vizsgáljuk az Ingbritt-féle törzs sejtalkotóin (a teljes sejtekből ultrahangos bontással előállított extrakt formájában) és az Ingbritt-féle törzs tenyészetének szűrletében található fehérjéken; a szűrletet előzőleg ammónium-szulfátos kicsapással koncentráljuk. Két csapadék vonalat kapunk, melyek megfelelnek az ultrahanggal kezelt anyag és a felülúszó antigénjeinek. Bármelyik antigén preparátum nem-specifikus proteolitikus enzimmel való kezelése (Pronase, Sigma Chemical Co. gyártmány) azt eredményezi, hogy az antiszérum hozzáadás után csapadék nem képződik. Ez utóbbi kísérlet bizonyítja az antigének fehérje természetét. Az antiszérum hatását az ultrahanggal bontott sejtre és a tenyészet szűrletére térhálósított anyagon végrehajtott immunoelektroforézissel vizsgálva — mely módszer érzékenyebb, mint az immundiffúziós — szintén csak két, az antigén/antitest kicsapási reakciónak megfelelő görbét kapunk. Ugyanezt a két antigént mutathatjuk ki, ha más, például „c” szerotípusú törzset extrahálunk és abból állítunk elő a fent leírt módon antiszérumot. Ilyen törzs például az NCTC 10 449 számon az Országos Törzsgyűjteményben letétbe helyezett törzs (Colindale, Anglia). A két antigén fizikai tulajdonságairól térhálósított anyagon végrehajtott immunoelektroforézissel kaphatunk képet; az első térirányban az elválasztást poliakrilamid gélen, izoelektromos tulajdonságok szerint (így a fehérjékét töltéskülönbségeik alapján választjuk szét), vagy NDS-poIiakrilamid gélelektroforézissel (így a fehérjéket molekulasúlyuk alapján szeparáljuk) hajtjuk végre. Azt az eredményt kapjuk, hogy az antigén A izoelektromos pontja 4,3 és molekulasúlya 29 000 ± 3000, míg az antigén B izoelektromos pontja 5,4 és molekulasúlya közel 200 000. A pontosabb NDS-poliakrilamid gradiens gélelektrofézissel az antigén A molekulasúlyára 29 000-et, az antigén B-ére pedig 190 000-et kapunk. A molekulasúly meghatározásához standardként használt fehérjék a következők voltak: nyúl miozin, M = 200 000; ß-galaktozidäz, M= 116 000; foszforiláz A, szarvasmarha szérum albumin, M = 68 000; ovalbumin, M = 43 000; kimotripszinogén A, M = 25 700. Az antigén B molekulasúlyára kapott érték még nem tekinthető véglegesnek, mert a különböző futtatásos módszerekkel ki lehetett mutatni, hogy ez az anyag szénhidrátot és glikoproteineket is tartalmaz, melyekről ismeretes, hogy gélelektroforézis során rendellenesen vándorolnak. Az Ingbritt-féle törzs NDS-sel extrahált sejtjei hatására termelődött antiszérumot felhasználtuk annak bizonyítására is, hogy az antigén A-nak és B-nek megfelelő antigéneket termel 6 másik, a „c” szerotípusba tartozó törzs (ezek közé tartozik az FW293, a C67—1, a GS—5 és az OMZ—70, melyek leírása megtalálható: Russell RRB, Microbios Letters, 2, 55—59, [1976]), valamint egyes, az „e” (P4 törzs) és az „f” (151 törzs) szerotípusba tartozó törzsek is. Ez utóbbi két szerotípus ugyanabba a genetikus csoportba tartozik, mint a „c” szerotípus (a Coykendall szerinti osztályozás I genetikus csoportja, melyre a Streptococcus mutáns Clarke nevet javasolták [Coykendall: Int. J. Syst. BacterioL, 27, 26—30, <(1977)], és kimutatták, hogy antigén szempontból igen hasonlóak (Bratthall et al: J. Dent. Res., 55A, 60—64, (1976) és Perch et al: Acta Path. Microbiol. Scand. Sec., B82, 357—370, [1974]) és hasonló fehérje összetételük van (Russell: Microbios Letters, 2, 55—59, [1976]). A „b” szerotípusba tartozó törzsek egy olyan antigént tartalmaznak, mely reakcióba lép az antigén A-val, míg az antigén B-vel reakcióba lépő antigének találhatók az „a”, „d” és „g” szerotípusba tartozó törzsekben és a Streptococcus sanguis törzsekben. 3. példa Tisztított antigén A előállítása Az antigén A-nak és B-nek tenyészetek szűrletéből való kimutatását követő kísérletek azt bizonyították, hogy mindkét antigén a sejtnövekedés során termelődik, akár Todd- Hewitt táptalajt, akár tripton/élesztő extraktot, akár pedig ismert kémiai összetételű (IKÖ) táptalajt használtunk, melyet Janda és Kuramitsu szerint állítottunk elő (Infect. Immun., 14, 191—202, [1976]). Mivel az IKÖ táptalaj kevesebb, a tisztítást megnehezítő anyagot tartalmaz, a kísérletek céljára ezt választottuk ki. Ingbritt-féle Streptococcus mutáns törzset IKÖ tápközegen tenyésztünk a korai stacionárius fázis eléréséig, majd a sejteket eltávolítjuk centrifugálással és üvegszűrőn való szűréssel. Ha elő akarjuk állítani a tiszta antigén B-t, a szűrletet oldhatatlan mutan glükózpolimerrel és poliakrilamid gél gyöngyökkel (BioGel P2) töltött kroma5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
