181799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kijanimicin előállítására
11 181799 12 Antibiotikum termelés A fent leírt második oltási szakaszban kapott oltóanyag 500 ml-ével 10 liter steril B táptalajt beoltunk. A fermentáló keveréket 27 °C és 35 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 30 °C-on, percenként 350 fordulattal keverve és percenként a fermentlé térfogatára számított 0,35 térfogat levegővel levegőztetve, inkubáljuk. Szükség esetén a fermentlé pH-ját híg sav vagy híg alkálilúg hozzáadásával 6,8 és 7.5 között tartjuk. Híg sav vagy híg bázis hozzáadására azonban rendszerint nincs szükség. A normális fermentálásban a pH értéke általában 7,5-ig emelkedik. majd a fermentálás végén közömbös kémhatásig csökken. Az antibiotikum elkülönítése és tisztítása A kijanimicint extrahálással úgy különítjük el, hogy a fermentlét vízzel nem elegyedő szerves oldószernek, például etilacetátnak a kivonatra számított 2 térfogatnyi mennyiségével kétszer extraháljuk. A kivonatokat egyesítjük, kis térfogatra bepároljuk, és a maradékot acetonban oldjuk. Dietiléter és hexán 6 :4 térfogatarányú elegyének hozzáadására a termék kiválik. A kapott bamássárga színű csapadékot szűréssel elválasztva és 40°C-on, vákuumban szárítva, kijanimicint kapunk. A kijanimicint kovasavgélen kromatografálva és alkalmas oldószerrendszerrel eluálva lehet tisztítani. A kijanimicinnek egyedülálló kémiai szerkezete van. Három molekula L-digitoxózból és egy molekula 4-O-metil-L-digitoxózból álló új tetraszacharid egységet tartalmaz. A tetraszacharid egység az aglikonban levő szekunder hidroxilcsoporthoz kapcsolódik. Az antibiotikum-molekulában egy új, elágazó láncú nitrocukor, a D-kijanóz is van, és ez szintén az ágiikon szekunder hidroxilcsoportjához kapcsolódik. A kijanimicin színtelen amorf szilárd anyag, 174.5 °C-on bomlik, és a következő jellemző fizikai-kémiai tulajdonságai vannak: IV. táblázat Elemi összetétele %: talált: C 60,78; H 7,94; N 1,96. Cô 7H1Q0N2O24 számított: C 61,08; H 7,65; N 2,13; O 29,14. pka 5,0 (a)*6 —116,4° (C 0,3%, CH3OH). Ultraibolya színképe: Amax (CF3CH2OH) 199 ran (E\fm 328,4), 242 nm (Ej* 56,2), 264 ran (E\fm 63,1), 274 nm (E\fm 60,7). *max (CH3OH) 0,1N HC1/260 nm (EJ* 60,8), Xmax (CH3OH) O.lNaOH) 236 nm (E{fm 103,9), 265 nm (E}fm 86,1), 276 nm (E\fm 83,4). Körpályás dikroizmusa: (0)194-176,O16, (0)216-176,016, (0)3OO + 11,479 (CF3CH2OH), Infravörös spektruma: 7max (CHC13)i 3690, 3620, 3540, 3480, 3440, 2970, '2940, 1755, 1733, 1623, 1545, 1515, 1318, 1232, 1130, 1060 cm'1 1 H-Mágneses magrezonancia-spektruma : 5h(CDC13) 0,65 (3H, d, J = 5Hz), 1,07 (3H, d, J = 7 Hz), 1,18 (3H,d,J26 Hz), 1,20-1,40 (jelek együttese), 1,60 (3H,s), 1,64 (3H,s), 3,45 (3H,s), 3,76 ppm. (3H,s) 13-C Mágneses magrenzonancia spektruma: S qCDCl3) 206,2, 201,5, 167,1, 157,4, 141,5, 137,1, 135,7, 126,7, 125,8, 123,6, 121,5, 119,3, 101.9, 99,8, 98,2, 97,1, 92,2, 91,0, 90,8, 84,5, 83.3, 82,6, 79,6, 78,4, 72,4, 71,8, 69,1, 68,1, 67.5, 67,1, 66,8, 65,1, 64,9, 64,4, 63,8, 62,6, 57.3, 53,8, 53,2, 52,7, 51,0, 43,1, 41,6, 40,2, 38.5, 36,8, 35,7, 35,5, 34,8, 34,4, 31,3, 31,1, 29.9, 29,7, 27,9, 25,3, 22,2, 20,2, 18,4, 17,9, 17.9, 17,9, 17,0, 15,1, 15,1, 14,0, 13,7. Molekulasúly és képlet Plazma-deszorpció tömegspektrometriával meghatározva a kijanimicin-metiléter molekulasúlyát 1331,5 ± 0,2-nek és tapasztalati képletét C6 8Hio2N2024-nek találtuk. Stabilitás A kijanimicin 6 és 10 pH érték között szobahőmérsékleten lényegileg stabilis, és 100 °C-ig terjedhető hőmérsékleten legalább 30 percig nem bomlik el. 2—3 pH-nál hatékonyságát gyorsan elveszti. Szerkezet A fenti fizikai adatok és az ágiikon diacetilszármazékán végzett röntgensugár kristallografiai tanulmányok alapján meghatároztuk a kijanimicin szerkezeti képletét, amit az (I) képlet szemléltet. Mivel a kijanimicin savas jellegű, fiziológiailag elfogadható (azaz farmakológiailag elviselhető) fémsókat vagy aminkationsókat alkothat. Eyen fémsók például az alkálifémekkel alkotott sók, azaz a lítium-, nátrium- és káliumsó, az alkáliföldfémekkel alkotott sók, azaz a magnézium- és kalcium-só. Az egyéb fémekkel alkotott sók, például alumínium-, cink- és vas-sók szintén a találmány körébe tartoznak. Az aminsókat a primer, szekunder és tercier aminokból származtatott aminsók képviselik. Alkalmas amin például a metilamin, dietilamin, trietilamin, etilamin, dibutilamin, triizopropilamin, N-metilhexilamin, decilamin, dodecilamin, allilamin, krotilamin, ciklopentilamin, diciklohexilamin, benzilamin, dibenzilamin, a-feniletilamin, /3-feniletilamin, etiléndiamin, dietiléntriamin és a hasonló alifás, cikloalifás és arilalifás, 1-18 szénatomos aminok, a 5 10 15 20 25 30 35 4Ö 45 50 55 60 65 6
