181684. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a kreatinkináz mb meghatározására
5 181684 6 sége miatt az 1979. március 2-án 2292 iktatószámon benyújtott német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben leírt eljárás. Ez az eljárás a luciferin-luciferáz reakciót használja fel, és kinetikusán méri az emittált fénymennyiséget. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi CK—MM-el szembeni olyan antiszérumok beadagolását CK— MB kvantitatív meghatározására, amelyeket bármilyen, az irodalomban leírt immunizálási eljárással állítottunk elő és eddig túl nagy CK—MB gátlásuk miatt szérumban nem voltak diagnosztikailag elfogadható CK—MB tesztre használhatók. A találmány szerinti eljárásban olyan antiszérumok is használhatók amelyek a gátláson kívül precipitációt okoznak. Nem kell többé elválasztani magukat a finomított immunizáló eljárások során nagyon jelentős mennyiségben keletkező, túl magas CK-MB gátlást mutató antiszérumokat, nincs szükség továbbá a költséges analitikai módszerekre sem a használható és nem használható antiszérumok megkülönböztetésére. Ez utóbbi különösen jelentős, minthogy az antiszérum CK—MB gátlását csak szívinfarktusos betegek friss szérumából készített CK-MB preparátumokon lehet kimérni. A gátló teszt elmaradása ezért jelentős egyszerűsítéshez vezet. A találmányt közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa Az IgG-frakció előállítása Olyan juhok szérumát, amelyeket a fentiekben idézett „immunologische Arbeitsmethoden” szakkönyvben ismertetett módon humán CK-MM-el immunizáltunk, 0 és 4 °C közötti hőmérsékleten és 7-es pH-értéken kristályos ammóniumszulfáttal keverjük össze 1,8 mól koncentráció eléréséig. A csapadékot centrifugálás után 0,1 mólos trisz/0,15 mólos NaCl-pufferben 8-as pH-értéken feloldjuk, és 7,1 pH-értéken 10 miílimólos foszfát pufferral szemben dializáljuk. Az újabb centrifugálással derített dializátumot Dl? ÀE a lulózzal töltött oszlopra viszszük. Azt a proteint, amit a OEAE-cellulóz nem köt meg (vagyis, ami oldatban átfolyik), egyesítjük a 15 miílimólos foszfát/10 miílimólos NaCl-pufferral (pH =7,1) eluálható proteinnal és így 95%-nál nagyobb tisztaságú IgG-t kapunk. b) Papainos hasítás Az IgG-t az Immunochem., 4. (1967) 369. irodalmi helyen leírt eljárással, redukáló körülmények között (10 mm cisztein) 1,5 súly% papainnal (az IgG-protein mennyiségére számítva) 7,5 pH-értéken 5 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. Az inkubáló fázis végén az enzim hatását jódacetamid (ciszteinre vonatkoztatva 3-8-szoros moláris) fölösleggel leállítjuk, és az elegyet a szabad SH-csoportok alkilezése céljából 2 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten, 7,5 pH-értéken. A stabilizált hasított elegy FAB-fragmenseket, Fc-fragmenseket és 10%-nál kevesebb IgG-t tartalmaz. Az immunreakcióképesség több, mint 75%. c) A FAB-fragmensek tisztítása A hasított elegyet ultraszűréssel 30 mg/ml-re betöményítjük, majd gélkromatográfiával [The LKB Instrument Journal, 24., (1977)] elválasztjuk. A FAB-fragmenseket mint utolsó protein-csúcsot eluáljuk, jól elválnak az IgG-től és az Fc-fragmensektől. A FAB-frakciót ultraszűréssel való betöményítés után közvetlenül felhasználhatjuk CK-MM vagy CK-MB gátlásra. A CK-MB gátlása a hibahatáron belül 50%-os. A CK-MM gátlása 99-100%-os. 2. példa a) '/-Globulin-frakció előállítása juhplazmából 4-6 hónappal azelőtt CK-MM-el immunizált juhok citráttal kezelt plazmájához 25 millimól koncentráció eléréséig kalciumkloridot adunk, és körülbelül 2 órán át szobahőmérsékleten alvadni hagyjuk. Az alvadék mechanikus szétoszlatása után az elegyet 1 térfogatrész fiziológiás konyhasó-oldattal felhígítjuk, és a lipoprotein adszorpció céljából 2% szilikát flokkulálószert (Aerosil) adunk hozzá. 4 °C-on 10 000 fordulat/perccel végzett centrifugálás után tiszta felülúszót kapunk. A felülúszóból 0 és 4 °C közötti hőmérsékleten és 7-es pH-értéken, 1,8 mól ammóniumszulfáttal kicsapjuk a 7-globulin-frakciót, majd centrifugálással (4 C, 10 000 fordulat/perc) összegyűjtjük. 50 millimól trisz/0,1 mól NaCl-pufferrel szemben 7,5 pH-értéken dializálva és ultraszűréssel betöményítve enzimes hasításra alkalmas antitest-preparátumot kapunk. b) Papainos hasítás Az l.b) példában leírt módon járunk el, azonban a 7-globulin-frakció miatt kissé módosítjuk az eljárást. A 7-globulin-frakció proteinjének 1 g-jára számítva 1,5% papint használunk, és az inkubálást 20 órán át végezzük 25 °C hőmérsékleten. A többi körülmény azonos. c) A F AB-frakció tisztítása Az alkilezett, hasított elegyet fiziológiás konyhasó-oldattal szemben dializáljuk, majd 25 millimól cinkszulfáttal keverjük össze [Immunochem., 14. (1977) 99.]. Ezáltal kicsapjuk a nem hasított IgG maradékát és a Fc-fragmenseket, és centrifugálással elválasztjuk őket. A visszamaradó FAB-fragmensek dializálás és betöményítés után alkalmasak a CK—MB próbában való felhasználásra. A kitermelés a kiindulási plazmára számítva a CK-MM izoenzim esetében a gátló aktivitásnak több, mint 80%-a. A CK—MB-t a nem hasított antitestek gátló értékétől függetlenül 50%-kal gátolja. A különböző szérumokkal kapott eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg. 5 H 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
