181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
9 181659 10 1.5. Microelisa lemezek bevonása nyúl anti-HPL immunoglobulinekkel Erre a célra nyúl anti-HPL immunoglobulin oldatot 25 fig immunoglobulin per ml tartalommal készítjük 0. 04.mól Na2HPC>4/liter oldatban, melynek pH-ját 7,4-re állítjuk 0,04 mól NaH2P04/liter koncentrációjú — mindkettő desztillált vízben — oldattal, amelyhez 0,1 g/l etil-merkuritio-szalicilsav-mononátriumsót (Merthiolate) adtunk. A fentiekben leírt immunoglobulin oldatból 0,1 ml-t viszünk a Microelisa lemez (polisztirolból készült mikrotitrációs lemezek, amelyeket a Dynatech cég állít elő) mindegyik mélyedésébe, majd a lemezt 16 órán át 0— 4 °C között inkubáljuk. 7,4-es pH-jú, 0,04 mol/l foszfát-pufferben levő 200 g/l BSA oldatból — amelyhez már 0,1 g/l Merthiolate-t adtunk — 0,1 ml-t minden egyes mélyedésbe pipettázunk és az egészet további 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A Microelisa®! lemezek nyílásait most már leszívatással kiürítjük és desztillált vízzel háromszor átmossuk, végül felhasználásig —20 °C-on tartjuk. 1.6. Vizsgálati előirat arany részecske — nyúl anti- HPL immunoglobulin konjugát felhasználásával végzett HPL mérésekhez 1.6ű Standard görbe felvétele a HPL-hez A HPL-hez a standard görbét az alábbi előirat szerint szerkesztettük. 1. A standard HPL oldatból 0,1 ml-t a MicroelisaR lemez mélyedéseibe pipettázunk, melyek nyúl anti- HPL immunoglobulinnal vannak bevonva és két órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. 2. A mélyedéseket — ezt követően — leszívatjuk és 0,1 ml 0,01 mol/l koncentrációjú és 7,4 pH-jú TRIS/ HC1 pufferrel átmossuk. 3. 0,1 ml arany részecske — nyúl anti-HPL immunoglobulin konjugátumot (Aj3g'nm = 1,00) a mélyedésekbe pipettázunk és ezt egy éjen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. 4. Ezután leszívatjuk és 0,3 ml 0,01 mol/l koncentrációjú és 7,4 pH-jú TRIS/HCl/NaCl pufferrel átmossuk. 5. 0,1 ml 0,1 mol/l vizes sósav oldatot pipettázunk a mélyedésbe és rázás közben 30 percig reagálni hagyjuk. 6. Az ezen oldatból vett mintát kis térfogatok mérésére alkalmas spektrofotométerbe helyezzük és megmérjük a fény abszorpciót 536 nm-en, vagy pedig a fényabszorpciót in situ mérjük a Microelisa-lemez mélyedésekben a Multiskan : Microelisa-leolvasó rendszer segítségével ugyancsak 536 nm-en. A standard görbe felvételéhez nyert eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza. A standard oldatban levő HPL koncentráció ng/ml A 536mnmakisérletvég 0 0,030 0,2 0,030 0,8 0,060 3,2 0,106 12,5 0,136 50 0,188 200 0,220 A HPL standard oldathoz szükséges oldószer 0,04 mol/l foszfát-puffer, 1 g/l BSA és 9 g/l NaCl 7,4 pH értékkel. 1.61 HPL meghatározása terhes nő vérsavójában A terhes nők vérsavóját úgy hígítottuk, hogy a HPL- szint 5 és 80 ng/ml között legyen. A vérsavó hígításához 0,04 mol/l koncentrációjú, 7,4 pH-jú foszfát-puffért haszn Htunk, amely 1 g/l BSA-t és 9 g/l NaCl-t tartalmazott. Az 1.6a pontban leírt vizsgálati előirat alapján a hígított vérsavó HPL koncentrációit a felvett standard görbe segítségével határoztuk meg. A hígítási faktor korrekciójával a következő eredményeket kaptuk. Vérsavó HPL tartalom, ETA teszt HPL tartalom, SPIA SPIA jelentése: szólrészecskés immunvizsgálat A 4,5 ±0,5 {ig/ml 4 ± 1 jMg/ml B 3,2 ±0,4 ßg/ml 3,5 ±0,8 fíg/ml C 0,7 ±0,1 fig/ml 1 ±0,3 [ig/ml II. példa HPL meghatározása aranyrészecskével jelzett antitesttel és atomabszorpciós spektrofotometriával 2.1. A reagensek és a bevont Microelisa-lemezek készítése Az arany részecske — nyúl anti-HPL immunoglobulin konjugátum, valamint a nyúl anti-HPL immunoglobulinnal bevont Microelisa lemezek előállításának eljárása azonos az I. példában leírtakkal. 2.2. Vizsgálati előirat 2.2« Standard görbe felvétele a HPL-hez A HPL standard görbéjének megszerkesztése céljából a következő HPL sorozat hígításokat végeztük: 1, 10, 100 és 1000 ng/ml, valamint a vak. A HPL oldószere 0. 04.mol/l foszfát-puffer, 7,4-es pH-val, amelyhez 1 g/l BSA-t és 9 g/l NaCl-t adtunk. 1. C,1 ml standard HPL oldatot a bevont Microelisa lemez mélyedésébe pipettázunk és ezt két órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. 2. Leszívatjuk és 0,1 ml 0,02 mol/l koncentrációjú, 7,4 pH-jú TRIS/HC1 pufferrel átmossuk. 3. 0,1 ml arany részecske anti-HPL antitest konjugátumot (A;3TMnm) a mélyedésbe pipettázunk és egy éjen át (kb. 16 óráig) inkubáljuk. 4. Leszívatjuk és 0,02 mol/l 7,4 pH-jú TRIS-pufferrel átmossuk. 5. 7,1 ml 0,1 mol/l koncentrációjú HCl-t a mélyedésbe pipettázunk és 30 percig rázógépben rázatva reagáltatjuk. 6. Ezen oldatból vett mintát helyezzük kis térfogatok injektálására alkalmas láng-atomabszorpciós spektrofotométerbe és mérjük meg a fényabszorpció csúcsértékét 242,8 nm-en. • * 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65. l5
