181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
11 181659 12 Az ily módon kapott standard görbe tipikus példáját az alábbi táblázatban szemléltetjük. Standard oldat HPL koncentrációja A vizsgálat végén 242,8 nm-nél mért fényabszorpciós csúcsértékek 0 ng/ml 0,020 1 ng/ml 0,040 10 ng/ml 0,160 100 ng/ml 0,200 Í000 ng/ml 0,220 2.2.6. Terhes nő vérsavójában a HPL meghatározása A terhes nő vérsavóját úgy hígítottuk, hogy a HPL szint 5 és 80 ng/ml között legyen. A vérsavó hígításához 0,04 mol/l foszfát-puffért (pH=7,4) használtunk, amely 1 g/1 BSA-t és 9 g/1 NaCl-t tartalmazott. A 2.2a pontban leírt vizsgálati előirat alapján, a megszerkesztett standard görbe segítségével a HPL koncentrációkat meghatároztuk. III. példa Hepatitis Bs antigén (HBsAg) vizuális kimutatása az arany részecske —juh anti-HBs immunoglobulin konjugátum segítségével 3.1. Arany-szol készítése Lásd 1.1. példát. 3.2. Juh anti-HBs vérsavó készítése Ajuhokat tisztított HBsAg oldattal injekcióztuk. 3.3. Juh anti-HBs immunoglobulin oldat készítése 1,4 g szilárd Na2S04-et adtunk 10 ml juh anti-HBsAg vérsavóhoz. Miután az összes nátrium-szulfát feloldódott, a zavaros folyadékot állni hagytuk egy órán át szobahőmérsékleten. Ezután a folyadékot 10 percig 25 000 N/kg értéken centrifugáltuk. A szupernatánst szívatással eltávolítottuk és a maradékot 10 ml 140 g/1 Na2S04 koncentrációjú desztillált vizes oldatban rediszpergáltuk. Ezt az eljárást még kétszer megismételtük. A legutóbb végzett centrifugálás valamint szupernatáns leszívatása után a szemcsét 10 ml 9 g/l NaCl koncentrációjú desztillált vizes oldatban feloldottuk. Az így nyert oldatot dializáltuk 610,3 g/l NaCl koncentrációjú desztillált vizes oldattal szemben, amelynek a pH-ját 7,0-re állítottuk 0,2 mol/l K2C03 oldattal. A dialízis 16 órán át, 4 °C-on történik, amely után a dializált folyadékot 20 percig 160 000 N/kg értéken centrifugáltuk. Az immunoglobulin oldatot 1 ml-es ampullákban —20 °C-on tároltuk. Az immunoglobulin tartalmat a már leírt A^“nm—A2ü;?nm módszer alapján meghatároztuk. 3.4. Arany részecske — juh anti-HBs immunoglobulin konjugát készítése A konjugát készítése azonos az I. példa 4. pontjában már leírt előállítási eljárással, azzal a különbséggel, hogy a juh anti-HBs immunoglobulin hígított oldatát (szintén 125 ng immunoglobulin/ml) használtuk a nyúl anti- HPL immunoglobulin oldata helyett. 3.5. Microelisa lemezek juh anti-HBs immunoglobulinokkal történő bevonása A Microelisa lemezek juh anti-HBs immunoglobulinokkal történő bevonását az l. példa 5. pontjában leírtak szerint végeztük, amikoris juh anti-HBs immunoglobulin oldatot használtunk a nyúl anti-HPL immunoglobulin oldat helyett. Tíz kontroll mélyedést tartalmazott valamennyi lemez. Ezeket a mélyedéseket olyan humán vérsavóból eredő immunoglobulin oldattal vontuk be, amelyek a következő vizsgálatokban negatív eredményt adtak: Hepanosticon : Schuurs, A. és Kacaki, J. : Vox Sang., 27, 97—114 (1974). Hepanostika: Wolters, G., Kuijpers, L., Schuurs, A. és Kacak’, J. : Z. Anal. Chem., 279,144 (1976). Monoshcon: Hoff, G. és Bauer, S.: J. Amer. Med. Ass., 194, 351—356 (1965). Rheumanosticon: Singer, J.: Amer. J. Med., 31, 766—768 (1961). — Imrr unodiffúzió normál juh vérsavóval szemben. — EIA anti-HBs meghatározására. 3.6. A vizsgálat leírása a vizuálisan értékelhető tesztnél 1. 0,1 ml mintát a bevont Microelisa lemez mélyedésébe pipettázunk és 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. 2. Valamennyi mélyedést 0,3 ml 0,02 mol/l 7,4 pH-jú TR1S/HC1 pufferrel háromszor átmossuk. 3. 0,1 ml arany részecske —juh anti-HBs konjugátumot (A^^LOO) a mélyedésbe pipettázunk és egy éjen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. 4. Leszívatjuk és 0,3 ml 0,01 mol/l 7,4 pH-jú TRIS/HCl/ NaCl pufferrel háromszor átmossuk. 5. 0,1 ml 0,1 mol/l HC1 desztillált vizes oldatát pipettázunk a mélyedésbe és 30 percig rázatás közben állni hagyjuk. 6. Vizuálisan értékeljük a mélyedésben levő folyadék színét és a kontroll helyekkel (mélyedésekkel) összehasonlítjuk. Azt a vérsavót, amely egy erősen pozitív reakciót adott a Hepanostika tesztben, még nyolcszoros hígításban is meg lehet különböztetni a kontrolloktói. IV. példa A tesztoszteron meghatározása ezüst részecske-tesztoszteron-lla-szukcinil-marha vérsavó albumin konjugátum segítségével 4.1. Az ezüst-szol készítése 8,5 ml 10 g/1 AgNOj desztillált vizes oldatát 486,5 ml desztillált vízzel hígítjuk és 5,0 ml 10 g/1 trinátrium-cit-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
