181659. lajstromszámú szabadalom • Fémszol-részecskével jelzett immuno-vizsgálati módszer
7 181659 Előnyösen a reagens-csomag szol-formájú fém-jelzett komponenst tartalmaz és a szol részecskéinek mérete 10 és 100 nm között váltakozik. Ezek akár közvetlenül az említett reakció komponensével, akár egy inert polimerrel — amelyhez a kívánt komponenst kapcsoltuk — bevontak lehetnek. A találmány szerinti reagens-csomag fém-jelzett komponense lehet egy fém-jelzett immunokomponens. A fém-jelzett komponens jelen lehet mint diszperzió, de váratlanul megfelelőnek bizonyult a stabil liofilezett termék, amelyet használat előtt rediszpergálhatunk. A liofilezett fém-jelzett komponens tartalmazhat pufferanyagot is, amely a specifikus kötődésű protein és annak megfelelő, kötődőképes anyag közötti reakció kivitelezéséhez szükséges. A találmány további megvilágítására a következő példák szolgálnak. I. példa Human placenta-laktogen (HPL) kolorimetrikus meghatározása nyúl anti-HPL szérumból származó antitest segítségével, amely arany részecskékkel van jelezve. 1.1. Az arany-szol készítése 500 ml 0,10 g/l koncentrációjú hidrogén-ftetraklór-aurát(III)]-oldatot desztillált vízben 800 ml térfogatú főzőpohárban forráspontig hevítünk. Trinátrium-citrát 10 g/l koncentrációjú desztillált vizes oldatából 3,5 ml-t adunk a forrásban levő oldathoz, majd az arany-szolt (amelynek kezdeti kék színe sötét vörösre változott) további 15 percig forraljuk. Szobahőmérsékletre történő hűtés után az ily módon nyert vörös arany-szolt mérőlombikban desztillált vízzel 500 ml-re egészítjük ki. A keletkezett arany-szol 45 és 70 nm közötti átmérőjű arany részecskékből áll, amelyet az elektronmikroszkópos vizsgálat igazolt. Az ily módon készített arany-szol pH-ja 3,45 ±0,07 között van, fényelnyelési maximuma 536 nm-nél, mialatt A5jg,m=l,15 ±0,03. 1.2. Nyúl anti-HPL szérum készítése Az anti-HPL szérumot úgy készítettük, hogy a nyuakba a HPL oldatot a következő séma szerint injekcióztuk : Nap Injektálás módja ü8 HPL Mennyi 9 g/l NaCl koncentrációjú oldatban oldva Komplett Lreundféle adjuváns í intramuszkuláris 100 0,5 ml 0,5 ml 15 intramuszkuláris 200 0,5 ml 0,5 ml 29 intramuszkuláris 400 0,5 ml 0,5 ml 48 intravénás 200 1,0 ml — 50 vér-mintavétel az antiszérum titerének meghatározására egy enzimimmún meghatározási módszer (ETA) szerint. A nyulakat kivéreztettük, mihelyt az EIA HPL vizsgálatban az antiszérum titere nagyobb volt mint 1: 5000. Ha ez nem következett be, akkor a nyulak intravénásán 200 (ig HPL (1,0 ml 9 g/l NaCl koncentrációjú oldatban) dózisú kiegészítő injekciót kaptak és az antiszérum literét ismét meghatároztuk ezen injekció beadása után 7 nappal. Az antiszérumot —25 °C-on tároltuk vagy fagyasztva szárítottuk és ezután a száraz port —25 °C-on tároltuk. 1.3. Nyúl anti-HPL szérumból anti-HPL immúnglobulin oldat készítése Ebbő! a célból 600 mg liofilezett nyúl anti-HPL szérumot 9 g/l koncentrációjú NaCl oldat 7,5 ml-ében feloldunk. Ezután 180 g/l Na2SQ4 desztillált vizes oldatból 10 ml-t hozzáadunk, majd 1,35 g szilárd Na2S04-ot. A keletkező zavaros folyadékot a centrifuga csövekben 1 órán át állni hagyjuk, amely után a folyadékot 10 percig 25 000 N/kg értéken centrifugáljuk. A szupernatánst leszívatjuk és a maradékot 180 g/l koncentrációjú desztillált vizes Na2S04 20 ml-ével rediszpergáljuk. Ezt a műveletsort még kétszer megismételjük. Az utolsó centrifugálás, és a szupernatáns elszívatással történő eltávolítása után, a maradékot 9 g/l koncentrációjú desztillált vizes NaCl 20 ml-ében feloldjuk. Ezt az oldatot desztillált vízben 0,3 g/l NaCl-ot tartalmazó 6 'iter dialízis folyadék ellen dializáljuk, melynek pH-ját 7-re állítottuk 1 liter desztillált vízben 0,2 mól K2C03-ot tartalmazó oldattal. A dialízist 16 órán át 4 °C-on folytatjuk, majd a dializált oldatot 20 percig 16 000 N/kg értéken centrifugáljuk. Az immunoglobulin oldatot 1 ml-es ampullákban —20 °C hőmérsékleten tároljuk. Az immunoglobulin tartalmat az immunoglobulin oldat tízszeres hígításában AjTMnm és AjTMnm értékek spektrofotométeres mérésével határozzuk meg. A mg/ml-ben kifejezett G immunoglobulin tartalmat a következő egyenlet segítségével számolhatjuk : G = 10 x (1,45 x AiTMm)—(0,75 x Aj^j. 1.4. Az arany részecske — nyúl anti-HPL immunoglobulin konjugát készítése Az 1.1. szerint leírt módon készített arany-szol 500 ml-éiek a pH-ját 7-re állítjuk 1 liter desztillált vízben 0,2 mól K2C03-at tartalmazó oldat segítségével. 0,5 ml nyúl anti-HPL immunoglobulin oldatot — mely 125 (ig immunoglobulint tartalmaz ml-enként — cseppenként élénk keverés mellett hozzáadjuk a semlegesített arany-szol 25 ml-éhez. Ezután szintén keverés mellett hozzáadjuk 5 mmol NaCl/liter desztillált vizes oldatban levő bovin-szérum albumin (BSA) 50 g/l koncentrációjú oldatának 0,5 ml-ét. Az ily módon nyert arany részecske — nyúl anti-HPL immunoglobulin konjugátumot 25 000 N/kg értéken 10 percig centrifugáljuk, majd a szupernatánst leszívatjuk. A konjugátumokat tartalmazó vörös labdacsokat 0,01 mol/liter koncentrációjú trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán oldat (TRIS) — melynek pH-ját 7,4-re állítottuk 1 liter desztillált vízben 0,01 mól HCl-t tartalmazó oldattal — olyan mennyiségével (kb. 23 ml) oldjuk fel, hogy a végleges A^”„m értéke 1,00 legyen. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
