181539. lajstromszámú szabadalom • Reagens lipázmeghatározáshoz és eljárás ennek előállítására
5 181539 6 A liofilizálásnál azepesav-sót, kolipázt, legalább 20 súly% védőkolloidot, a tartósítószer legalább egy részét és adott esetben az aktivátort hozzá kell adni az elegyhez. A liofilizálásra kerülő vizes emulzió készítésének egy előnyös eljárása az, hogy az említett alkotórészeket, a triglicerid kivételével, feloldjuk vizben, és utána keverés közben vékony sugárban befecskendezzük az oldatba a triglicerid valamilyen illékony szerves oldószerrel készült oldatát. Illékony szerves oldószerként különösen 1—4 szénatomos alifás alkoholok és ketonok megfelelők. A találmány szerinti reagens fennmaradó alkotórészeit, nevezetesen a pufferanyagot, karbamidot és adott esetben további védőkolloidot, tartósítószert és aktivátort a liofilizátumhoz közvetlenül elkészítése után vagy csak később adjuk hozzá. Mint már említettük, meglepően azt találtuk, hogy a találmány szerinti reagens a rekonstitúció után olyan extinkciót vagy olyan időegységenkénti extinkcióváltozást eredményez, amely messzemenően független a kiindulási emulzió extinkciójától és a reagens elkészítésétől. Ezenkívül a rekonstruált emulzió extinkciós állandója meglepően jó. Az epesavsókat előnyösen megtisztítjuk a szennyezésektől, így bomlástermékektől és hasonlóktól, például n-butanollal lúgos körülmények között végzett extrakcióval, alkohol/aceton elegyből végzett átkristályosítással és hasonló tisztítási módszerekkel. A találmány szerinti reagens ezen meglepő tulajdonságát a liofilizálás előtti és utáni cseppnagyság-eloszlás meghatározásával vizsgáltuk egy Coulter-részecskeszámláíó segítségével. Ezzel a készülékkel meg lehet határozni a 480— 16000 nm átmérőjű részecskék százalékos eloszlását 100— 1000 nm tartományban. Azt találtuk, hogy a cseppnagyság a liofilizálás előtt tételről tételre nagyon erősen ingadozott, a liofilizálás és adott esetben további műveletek, így a reagens többi alkotórészeinek hozzákeverése és hasonlók után viszont mindig jól egybevágó eloszlási képet kaptunk. (Termodinamikai egyensúly beállása). Az igy előállított szárazemulzió továbbá azzal tűnik ki, hogy cseppeloszlása nagyon jól állandó marad termikus terhelés (3 hét/35 ’C) esetén is. A cseppeloszlás maximumát 500—1000nm-nél találtuk. Ezért különösen alkalmas a zavarosodás-megszűnés 340 vagy 365 nm-nél való fotometriás követésére. A trigliceridcseppecskék lebontása 340 nm-nél lényegesen kisebb részecskeméretnél már nem állapítható meg, nagyobb cseppecske viszont nem ideális szubsztrát a lipáz részére. A találmány szerinti reagens lényeges előnye az, hogy mind humán pankreász-lipáznál, mind sertés pankreászlipáznál időegységenként azonos aktivitásváltozást mutat. Mivel a Rick-féle titrimetriás tesztben ez a két lipáz szintén azonos aktivitáskoncentrációt mutat, kalibrálásra sertéspankreász tartalmú standard alkalmazható. A találmány szerinti reagens további lényeges előnye, hogy nincs lag-fázis. Ismeretes, hogy turbidimetriás lipáztesztnél csak bizonyos idő múlva áll be nulladrendű reakciólefutás. Az ilyenfajta reakciólefutás viszont egy enzim aktivitáskoncentrációjának pontos meghatározásához feltétlenül szükséges (lásd H. U. Bergmeyer: Grundlagen der enzymatischen Analyse, 1979., 10/22., 58. old.-tól). Ennek a reakciólefutásnak az eléréséig eltelő időt hívják lag-fázisnak. A következő példák a mellékelt ábrákkal együtt a találmány további magyarázatául szolgálnak. Az ábrákon levő rajzok grafikus ábrázolásban mutatják az emulzió részecskenagyság-eloszlását, amelyet Coulter-részecskeszámlálóval kaptunk különböző példákban és leírt kísérletekben, 1. példa 0,06 g kalcium-kloridot, 22,72 g nátrium-dezoxikolátot, 25,35 g 4000-es molekulasúlyú polietilénglikolt, 1,1 g nátrium-azidot, 0,02 g kolipázt gyártja Boehringer Mannheim GmbH) és 50,8 rész mannitot feloldunk 1,0 liter desztillált vízben. A kapott oldatba keverés közben befecskendezzük 2 bar nyomással egy 1,5 mm átmérőjű fúvókán át 1,42 g triolein 32 ml n-propanollal készült oldatát. Az így kapott triolein-emulziót —40 °C-on megfagyasztjuk, és liofilizálással szárítjuk. 8,95 g nátrium-dezoxikolátot, 7,85 gTRIS-t 1,20 gTRIS- hidrokloridot, 7,5 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 1,97 gnátrium-kloridot, 16,2 g karbamidot és 56,9 gmannitot szárazon összekeverünk egymással. Az így kapott pufferkeverékből 2 súlyrésznyit spirálkeverővel homogén reagenssé keverünk 1 súlyrésznyi Uofilizátummal. A lipázmeghatározás kivitelezése céljából 150 mg ilyen reagenst 2,5 ml vízzel oldunk, 0,1 ml mintával elegyítjük, és fotometriásan métjük 365 nm-nél 25 °C-on vízzel szemben. Mintaként például szérum, duodenum-nedv, vizelet és más folyadékok használhatók. A módszer pontosságát a Rick-féle titrimetriás módszerrel való összehasonlítással ellenőriztük, 60 különböző lipázaktivitású humán-szérum vizsgálatánál a következő adatokat kaptuk: Korreláció: (x=Rick; Y=találmány szerinti teszt) Y=0,93 • x-20; r=0,96. A teszt linearitása körülbelül 1300 Rick-egységig megmarad. Egy Rick-egység= 1 pmól szabaddá vált zsírsav/ perc=lU. 2. példa 1,500 g mannitot, 0,900 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 0,524 g nátrium-dezoxikolátot, 1,5 mg kolipázt és 8 mg nátrium-azidot feloldunk 50 ml desztillált vízben. Ebbe az oldatba keverés közben kislyukú fúvókán át befecskendezzük 150 mg triolein 5,1 ml propanollal készült oldatát. A kapott emulziót -40 °C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk. 3,50 g karbamidot, 3,73 g nátrium-dezoxikolátot, 0,4 g nátrium-kloridot, 0,10 g nátrium-azidot, % mg kalciumkarbonátot, 1,355 g TRIS-t és 0,200 g TRIS-hidrokloridot bensőségesen összekeverünk egymással. Ehhez a keverékhez hozzáadjuk a felaprított száraz liofilizátumot, és homogénné keveijük. A teljes keverék 12;27 g, a következőket tartalmazza: Mannit 1,500 g Polietilénglikol 0,900 g összeg=2,4 g = 19,4 súly%, Nátrium-dezoxikolát 4,254 g = 34,4 súly%, Kolipáz 1,5 mg Nátrium-azid 9 mg TRIS 1,355 g TRIS-hidroklorid 0,200 g összeg= 1,555= 12,6 súly%, Karbamid 3,5 g = 28,3 súly%. 37 mg ilyen keveréket oldunk 2,5 ml desztillált vízben, 200 pl mintával (szérum) elegyítjük, és 340 nm-nél és 25 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
