181539. lajstromszámú szabadalom • Reagens lipázmeghatározáshoz és eljárás ennek előállítására
3 181539 4 azonosan maradó szubsztrátfelület — a cseppnagyság tekintetében is — szükséges. Az emulzió minősége mindig nagyon erősen függ a készítés technikájától, és mivel természetszerűleg a kivitelezésnél bizonyos előírások betartása más — más személyeknél nem azonos, így a mért aktivitási értékekben jelentős különbségek lépnek fel. Ezt a nehézséget is el kell kerülni a találmánnyal. Ezt a feladatot különösen a lipáz turbidimetriás meghatározására alkalmas rekonstruálható szárazreagenssel oldottuk meg, amely víz hozzáadásakor szubsztrátolajat, védőkolloidot, emulgeátort és aktivátort tartalmazó emulziót képez, amelyre az jellemző, hogy 0,2—10 súly% folyékony, 14—22 szénatomos zsirsavcsoportokat és 1—8 szén-szén kettős kötést tartalmazó trigliceridet, 20—90 súly% védőkolloidot, 5—60 súly% epesav-alkálifém-sót, 0,001—0,1 súly% kolipázt, 5—20 súly% karbamidot, 3—50 súly% 6,0—10,5 pH-hoz alkalmas pufferanyagot és 0,5—5 súly% alkálifém- vagy alkáliföldfémsó aktivátort és adott esetben 0,1—2,0 súly% tartósítószert tartalmaz. Meglepődve tapasztaltuk, hogy egy találmány szerinti összetételű szárazreagensnél állandóan maradó kvantitatív összetétel esetén a rekonstruált emulzió megbízhatóan állandóan azonos cseppnagyságát érjük el, és azonkívül a szubsztrátfelület minőségét is reprodukálhatóan úgy állítjuk be, hogy mindig nagy reakciósebességet és nulladrendű reakciólefutást érünk el, ami előfeltétele egy gyakorlatban jól kivitelezhető turbidimetriás, kinetikus aktivitásmeghatározásnak. A kvantitatív összetételnek a fentebb a reagens egyes alkotórészeire megadott változtatási lehetőség keretein belül való változtatásával az elkészítéstől függetlenül a rekonstruált emulzió meghatározott cseppnagysága állítható be. Mivel a trigliceridtartalomtól függ a reagensadalék kezdeti extinkciója, rendszerint egy bizonyos kívánt trigliceridkoncentrációból kell kiindulni, és a szokásos alkotórészek mennyiségeit azután az elérni kívánt cseppnagyságra való tekintettel a mindenkori adottságokhoz igazíthatjuk. Trigliceridként mind természetes, mind szintetikus trigliceridek megfelelők, amelyek 14 és 22 közötti szénatomszámú zsírsavak észterei. A hosszú szénláncú telítetlen zsírsavakat tartalmazó trigliceridek bizonyultak előnyösnek, különösen az olyan trigliceridek, amelyekben 14—20 szénatomos és 1—8, előnyösen 1—3 szén—szén kettőskötést tartalmazó zsírsavak vannak. Könnyű hozzáférhetősége miatt a triolein különösen előnyös, olívaolaj is nagyon jól megfelel. Az előnyös triglicerid mennyiség 0,2—2,0 súly%. Védőkolloidként a vegyészek által az ilyen célra ismert anyagok jönnek számításba, így polihidroxi-vegyűletek, szérumalbumin, polivinilpirrolidon, szilárd polietilén-oxidok és hasonlók. Előnyösek a polihidroxi-vegyűletek, különösen a molekulánként 1—10 pentóz- illetve hexóz-egységet tartalmazó monomer vagy polimer pentóz- vagy hexóz-származékok és/vagy a szobahőmérsékleten szilárd polietilénglikol. Alkalmas polihidroxi-vegyületekre előnyös példa mannit és hasonló cukoralkoholok, a glükóz, mannóz, maltoheptaóz oligoszacharidjai, 3500 és 7000 közötti átlagos molekulasúlyú polietilénglikol és egyebek. Egyéb használható védőkolloidok például aminosavak, így alanin, növényi gumik, így gumiarábikum stb. A védőkolloid, illetve védőkolloid elegyének előnyös mennyisége 50—70 súly%. Különösen megfelelőnek bizonyult cukoralkohol és polialkilénglikol elegye. Epesavként az ismert felületaktív epesavak, így kólsav, taurokólsav, dezoxikólsav, taurodezoxikólsav, glikodezoxikólsav, illetve ezek alkálifémsói, különösen a nátriumsók jönnek számításba. Az előnyös mennyiség 10—15 súly%. A találmány szerinti reagens egy további lényeges alkotórésze a kolipáz, ez egy kisebb molakulasúlyú protein, amely epesavsó jelenlétében aktiválja a lipázt (Biochem. et. Biophys. Acta, 271., 400—421., 1972. és Eut. J. Biochem., 58., 555—559., 1975.). Az előnyös mennyiség 0,003—0,01 súly%. Tartósítószerként a találmány keretén belül olyanokat alkalmazunk, amelyek a meghatározandó lipáz enzimaktivitását nem befolyásolják. Különösen megfelelőek az alkálifém-azidok, főleg a nátrium-azid. Más tartósítószerek, így például tioazid és egyéb kéntartalmú tartósítószerek is éppen megfelelnek. A tartósítószer előnyös mennyisége 0,2— 0,7 súly%. A találmány szerinti reagens továbbá karbamidot is tartalmaz, előnyösen 10—15 súly%-nyi mennyiségben. Pufferanyagként minden olyan ismert puffer megfelel, amely a találmány szerinti reagens keretein belül 6,0 és 10,5 közötti pH-érték tartására képes. Az előnyös pH-tartomány 8,3 és 9,5 közötti. Alkalmas puflferok például: dietanol-amin-puffer, trietanol-amin-puffer, TRIS-puflfer és Good-puflferok, [lásd Biochemistry, 5., (1966) 467. oldaltól], így HEPES- puffer (jól megfelel a liofilizálás előtt való hozzáadás céljára), TAPS-puffer és bicin [(HOCH2CH2)= + NHCH2COO \ Különösen előnyös a TRIS-puflfer. Az előnyös puflfermenynyiség 3—10 súly% közötti. További aktivátor a kalciumion. Minthogy a kalciumionok dezoxikólsawal oldhatatlan csapadékká alakulnák, kalcium jelenlétében epesavként a taurodezoxikólsav az előnyös, mert ez magasabb — 1— 5 mmól tartományba eső — kalcium-koncentrációt tesz lehetővé. Az említett lényeges alkotórészeken kívül a találmány szerinti reagens meghatározott célokra még inert adalékanyagokat (töltőanyagokat) is tartalmazhat, amelyek a kezelést megkönnyítik. Végül a találmány szerinti reagens aktivátort is tartalmaz a lipáz részére. Lipázaktivátorok ismertek. Előnyösek a kloridok, különösen nátrium-klorid, de más alkálifém- vagy alkáli földfém-kloridok is alkalmazhatók, amennyiben nem képeznek oldhatatlan vegyületeket a találmány szerinti reagens vagy a minta más összetevőivel. Magnéziumionok is aktiválólag hatnak. A találmány szerinti reagens egyes alkotórészeinek a hatásmódja a találmány keretein belül nem minden tekintetben világos. Feltételezzük azonban, hogy a kolipáz az enzimnek a nagy epesavtartalomra, különösen a dezoxikolátra, taurodezoxikolátra vagy glikodezoxikolátra gyakorolt hatását fokozza, és javítja a reakciólefutás linearitását. Úgy tűnik, hogy a karbamid az emulzió víz/lipid határfelületére befolyással van, és ezt stabilizálja. A találmány szerinti szárazreagenst az alkotórészek szokásos módszerekkel előállított emulziójának liofilizálásával készítjük. A pufferanyagot, karbamidot és adott esetben a védőkolloid és a tartósítószer valamint adott esetben az aktivátor egy részét is előnyösen csak a „szárazemulzió” liofiüzálása után adjuk hozzá. A liofilizálásnak alávetendő emulzió a szokásos módszerekkel állítható elő, például az összes alkotórészek a vizes oldószerhez való hozzáadásával, szokásos módszerekkel, így ultrahanggal, kolloidmalommal és hasonlókkal történő emulgeálásával, és végül körülbelül —40 °C-on végzett fagyasztásával, & vákuumban a szokásos körülmények között, tehát körülbelül 10 A—10 4 torr nyomáson történő szárításával. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
