181494. lajstromszámú szabadalom • Enzimes mikrobiológiai eljárás optikailag aktív aminosavak előállítására
5 181494 6 pH = 7,7), amely 10 g D,L-5-fenilhidantoint tartalmaz, 40 C° hőmérsékleten UPP nitrogén-sátor alatt feliszapoljuk. Ilyen körülmények között ezt 200 óra hosszat inkubáljuk, azalatt aminosavvá történő teljes hidrolízist érünk el (D- fenilglicin keletkezik), amelyet a reakcióelegy polarometriás analízisével és vékonyréteg-kromatográíiával mutatunk ki Suzuki által a J. of Chromatograpgy, 80 (1973), 199—204. irodalmi helyen leírt módon. Az aminosavat elkülönítjük a reakcióelegyből oly módon, hogy a proteineket triklórecetsavval kicsapjuk és centrifugálással elkülönítjük, a pH-t az izoelektromos pontra (5,8) állítjuk. A csapadékot vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk. A D( - )-fenílglicin aminosavnak az azonosságát IR és NMR spektrumokkal bizonyítjuk. A fajlagos optikai forgatóképesség:[a]p = -154 fok (c= 1% 1 normál HCl-ben) szemben az irodalomban a tiszta aminosavra megadott - 157,8 értékkel. 2. példa Az 1. példában leírt módon 100 ml táptalajból készített sejteket feliszapolunk 10 ml pirofoszfát pufferben (0,1 mól, pH = 7,7) és a szuszpenziót 10 percig hangsebességű keverővei keverjük. Ezután a szuszpenziót 20 mmól D,L-karbamoilfenilglicin 500 ml-nyi pirofoszfátos pufferes oldatához (0,1 mól pH = 7,7) adjuk és 65 C°-on inkubáljuk. A reakciókinetikát úgy követjük, hogy megállapítjuk az N-karbamoil hidrolízisénél felszabaduló ammóniumot a fenol-hipokloritos módszerrel. 40 órás inkubálás után az NH4+ -koncentráció 10 millimól/ liter értéket ér el és az idő előrehaladásával már nem észlelhető további növekedés. Ezután a reakcióelegyet 50 C°-on vákuumban betöményítjük 100 ml-re. Ezt követően az elegy pH-ját 5,8-ra állítjuk tömény sósavval és a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük. A csapadékot, amelyet így kapunk, 1 n sósavoldatban oldjuk és 5,8 pH-n NaOH-val ismét kicsapjuk. Szárítás után a fajlagos optikai forgatóképességet meghatározzuk, ennek nagysága - 153°. Az IR spektrum megerősíti az aminosav azonosságát. A szűrletből, amelynek a pH-ját óvatpsan 3 n sósavoldattal jeges fürdőben 2,5 értéken tartjuk, csapadékot kapunk, amelyet kiszűrünk és a szűrletet szárazra pároljuk, majd a maradékot forró, vízmentes etanollal extraháljuk. Lehűléskor az alkoholos oldatból kristályos csapadék válik ki, amelyet szárítás után vékonyréteg-kromatográíiával és IR módszerrel vizsgálunk. Ezek az elemzések megerősítik azt, hogy kémiailag tiszta N-karbamoilfenilglicin van jelen. A fajlagos optikai forgatóképesség[a]o = 134° (c= 1% 1 n NaOH-ban) szemben a + 137°-os értékkel, amelyet az irodalom ad meg az L-enantiomerre. 3. példa Az 1. példa szerint készített pre-kultúrával öt darab 500 ml-es lombikot beoltunk. A lombikok mindegyike 100 —100 ml kizárólag 5%-os gabonaáztató folyadékot tartalmaz, ennek pH-ját NaOH-val 7,8-ra állítjuk és 121 C°-on 30 percig sterilizáljuk. A tenyészetet 24 óra hosszat 30 C*-on orbitális keverés közben (220 ford/perc) inkubáljuk. A sejteket centrifugálissá' elkülönítjük, pirofoszfát-pufferrel (0,1 mól pH = 7,7) mossuk és utána 100 ml ugyanilyen pufferrel feliszapoljuk, amely még 10 gramm 5-parahidroxi-D,L-fenilhidantoint tartalmaz és 40 C°-on UPP nitrogénsátor alatt inkubáljuk. Az inkubálást 160 óra hosszat végezzük ilyen körülmények között, eközben bekövetkezezik a teljes hidrolízis aminosavvá (parahidroxifenil-glicinné, mégpedig D( —)-formává. Ezt a reakcióelegy polarimetriás és vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálata mutatja, amelyet Suzuki [J. of Chromatography, 80 (1973) 199—204] módszere szerint végzünk. Az aminosavakat kinyerjük a reakcióelegyből oly módon, hogy a proteineket triklórecetsavval kicsapjuk és a csapadékot cfentrifugálással elkülönítjük, miközben a pH-t az izoelektromos pontra (5,2) állítjuk be. A csapadékot vízzel mossuk és vákuumban szárítjuk. Az aminosav azonosságát IR és NMR spektrumok alapján bizonyítjuk. A fajlagos optikai forgatóképesség[a]o = —156,5° (c=l% In HClben), szemben a tiszta aminosavra az irodalomban megadott - 161,2° értékkel. 4. példa 100 ml gabonaáztató folyadék alapú táptalajból származó Agrobacterium sp. törzs sejteket használunk az 1. példában megadott módon. A mosott sejteket 10 ml pirofoszfát-pufferben (0,1 mól pH = 7,7) feliszapoljuk és 15 percig keverés közbn szobahőmérsékleten toluolozzuk. A toluolozott szuszpenziót 20 mmól N-karbamoil-D,L- parahidroxifenilglicin 500 ml-nyi pirofoszfátos pufferes oldatához (0,1 mól pH = 7,7) adjuk és UPP nitrogénsátor alatt 65 C°-on inkubáljuk. A reakciókinetikát úgy követjük, hogy megállapítjuk az N-karbamoil-származék hidrolízisénél felszabaduló ammónium-ionok mennyiségét a 2. példában említett fenol-hipokloritos módszerrel. 18 órás inkubálás után az NH4 -ionkoncentráció 10 millin'ól/liter értéket ér el, utána az idő előrehaladásával már nem észlelhető további növekedés. Ebben az állapotban a reakcióelegyet 50 C°-on vákuumban 100 ml végső térfogatra betöményítjük. Ezt követően az elegy pH-ját tömény sósavval 5,2-re állítjuk be és a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük. Ezt követően a 2. példában leírt módon járunk el, D- aminosavat és N-karbamoil-L-származékot különítünk el, majd azonosítjuk. A fajlagos optikai forgatóképességek értékei - 157,2° és +171°, szemben a tiszta termékekre az irodalomban megdott - 161,2° és + 175,4° értékekkel. 5. példa Agrobacterium sp. törzs sejtjeit készítjük el az 1. példában megadott módon. Néhány gramm sejtszuszpenziót feliszapolunk pirofoszfát-pufferben (0,1 mól pH = 7,7) és hidegen acetonnal kezeljük. Ezután az acetont szűréssel elkülönítjük és az így kapott acetonos készítményt vákuumban 35 C°-on állandó súlyig szárítjuk. A szárított anyagot dörzscsészében homogenizáljuk és az így kapott port az enzimaktivitás vizsgálathoz használjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
