181494. lajstromszámú szabadalom • Enzimes mikrobiológiai eljárás optikailag aktív aminosavak előállítására
181494 8 7 A fentiek szerinti port a következő anyagokon vizsgáljuk: N-karbamoil-D-( —)-alanin, N-karbamoil-D-(-)-valin, N- karbamoil-D-( - )-glutaminsav, N-karbamoil-D-( - )-parahidroxifenilglicin, N-karbamoil-D-(—)-parametoxifenilglicin, N-karbamoil-D-(-)-fenilglicin, N-karbamoil-L( + )- 5 fenilglicin, N-karbamoil-D-( — )-fenilalanin, N-karbamoil- L( + )-glutaminsav -s az N-karbamoil-D(-)-(2-tienil)-glicin. így 20 mmólos oldatot készítünk mindegyik karbamoilszármazékból 0,1 mólos 7,7 pH-értékű pirofoszfát-pufferrel és mindegyik oldat 10 ml-nyi mennyiségéhez hozzáadunk 10 egyenértéknyi mennyiségű acetonos port, minden anyagra egyenlő mennyiségben. Az inkubálást UPP nitrogénsátor alatt végezzük keverés közben 40 C°-on. Egy óra hosszat tartó inkubálás után a termelt aminosav mennyiségét mérjük oly módon, hogy a 15 reakciókeverékekben meghatározzuk a felhalmozódott NH4 -ionok koncentrációját a 2. példában leírt fenol-hipoklorit módszerrel. Azt találtuk, hogy a karbamoil-származékokra ható enzim legnagyobb aktivitást N-karbamoil-D(-)-parahidroxi- 20 fenilglicinnel szemben mutat. Az 1. táblázatban megadjuk a kísérletek eredményeit, 100-nak fogadjuk el az N-karbamoil-D(-)-parahidroxifenilglicinnel szemben tanúsított hidrolitikus aktivitást. Anyag %-os aktivitás N-karbamoil-D( - )-alanin 57,5 N-karbamoil-D( - )-valin 34,25 N-karbamoil-D( - )-glutaminsav 21,7 N-karbamoil-L(+)-glutaminsav 0 N-karbamoil-D( - )-parahidroxifenilglicin 100,0 N-karbamoil-D( - )-parametoxifenilglicin 40,0 N-karbamoil-D(- )-fenilglicin 81,25 N-karbamoil-L( + )-fenilglicin 0 N-karbamoil-D( - )-(2-tienil)-glicin 40,7 N-karbamoil-D( - )-feni!alanin 50,0 6. példa A következő összetételű táptalajt készítjük el: MgS04 • 7H20 0,2 g Na2HP04 12HjO 6 g kh2po4 3 g nh4ci 2 g NaCl 0,5 g glicerol 5 g 5-fenil-D,L-hidantoin 2 g élesztőkivonat 0,1 g desztillált víz 1000 ml 30 35 40 45 50 A közeget 100 ml-es adagokban 500 ml-es lombikokban elosztva 116 C°-on 30 percig sterilizáljuk. Hidantoint szűrés- 55 sei sterilizálunk. Valamely I. példa szerint készített pre-kultúrából 5— 5 ml-nyi adagokat oltunk az egyes lombikokba és a tenyészetet 30 C°-on 36 óra hosszat inkubáljuk 220 ford/perc orbitális keverés közben. Ezt követően a sejteket centrifugálással kinyerjük és az aminosavat a felülúszóból kapjuk betöményítés és a felülúszónak az izoelektromos pontra való beállításával. Ezután 10 liter ily módon kezelt táptalajból 11,2 g D( - )-fenilglicint kapunk, amelynek a fajlagos optikai forgatóképessége [a]í> = -156’ (c=l% 1 n HCl-ben) szemben a tiszta aminosavra az irodalomban megadott -157,8° értékkel. 7. példa A következő összetételű táptalajt készítjük el: MgSO* • 7H20 0,2 g Na2HP04 ■ 12H20 6 g kh2po4 3 g 6-metil-hidantoin 2 g NaCl 0,5 g glükóz 1 g élesztőkivonat 0,1 g desztillált víz 1000 ml PH 7,1 A tápközeget 100 ml-es adagokban 500 ml-es lombikokban elosztva 116 C°-on 20 percig sterilizáljuk. Metilhidantoint elkülönítva sterilizálunk. Valamely 1. példa szerint készített pre-kultúrából 5— 5 ml-nyi adagokat.oltunk az egyes lombikokba és a tenyészetet 30 C°-on 24 őrá hosszat inkubáljuk 220 ford/perc sebességű orbitális keverés közben. Ezt követően a sejteket centrifugálással kinyeijük 1000 ml táptalajból, foszfát-pufferben (pH = 7,5) mossuk és 100 ml ugyanazon pufferben 4 g DL-5-(2-tienil)-hidantoint kapunk. A reakcióelegyet 40 C°-on UPP nitrogénsátor alatt inkubáljuk. A hidrolízis 30 órás reakcióidő után teljessé válik és így az aminosavat [D(- )-(2-tienil)-gIicin] kapjuk. Az aminosavat úgy különítjük el, hogy a reakcióelegyet 20 ml-es végső térfogatra betöményítjük és a pH-t 5,6-ra állítjuk be. Az így kapott csapadékot vákuumban szárítjuk. Az aminosav azonosságát IR és NMR spektrumok igazolják. A fajlagos optikai forgatóképesség [<!]□ = -72,6* (c= 1% vízben) szemben az irodalomban tiszta aminosavra megadott — 73,7° értékkel. Szabadalmi igénypontok Eljárás D-aminosav előállítására N-karbamoil-származékainak racém elegyeiből vagy a megfelelő hidantoinokból kiindulva, azzal jellemezve, hogy a reakciót az Agrobacterium genus miroorganizmusaiból célszerűen az NRRL B 11 291 jelű törzsből kapott enzimkomplexek jelenlétében hajtjuk végre. 1 ábraoldal A kiadásért felei a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 85.5402.66-4 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató
