181494. lajstromszámú szabadalom • Enzimes mikrobiológiai eljárás optikailag aktív aminosavak előállítására
3 181494 4 dasági talajból izolálunk. Ezeket 1302,1303 és 1304 számokkal jelöljük. Ezek a következő morfológiai és biokémiai tulajdonságokkal rendelkeznek: Mikroszkopikus morfológia: Különálló pálcikák, olykor párosulnak, gram-negatív, 0,8 x 1,5—2,0 mikron, tok és spórák hiányzanak; 4—6 ostorral mozog. Makroszkopikus morfológia) 7,5 pH-n végezzük. Glükózt, laktátot, acetátot, gabonaáztató folyadékot és laktózt használhatunk szénforrásként. Húshidrolizátumok, kazein- és szójababhidrolizátumok, ammóniumsók és karbamid, hidantoinok és aminosavak 5 N-karbamoil-származékai szolgálnak nitrogénforrásként. Valamely megfelelő tápközeg például a következő összetételű lehet: húspepton, 5 g húskivonat 5g glükóz 5g desztillált víz 1,000 ml pH 7,0—7,2 Kolóniák agar táptalajon (Difco): kiemelkedett, töretlen szegély, krémszínű, átlátszó, 0,5 1 mm átmérő, egyenletes 15 felület, gazdagon növekszik kalciumglicerofoszfát-mannitolnitrát agaron, bámulással és gyűrűképződéssel. Biokémiai jellemzők: 20 Növekedés 4 C° és 39 C° között minden egyszerű laboratóriumi közegen, növelő komponensek és aminosavak nélkül is, egyedüli nitrogénforrásokként NHÍ, N03 vagy aminosavak szolgálnak. Oxidáz: pozitív (N. Kovács, 1956, Nature, London, 178, 25 703) Kataláz: pozitív (M. Levine, D. Q. Anderson, 1932, J. Bact. 23, 337—347). Nitritek képződnek nitrátokból (C. E. Zobell, 1932, J. Bact. 24, 273). 30 Twenn 80 nem hidrolizál (C. Sierra, 1957, Antonie van Leeuwenhoek, 23, 15—22). Kazein, zselatin, cellulóz, keményítő, agar: nem hidrolizál. (V. B. D. Skermann, A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria, 2nd Edition, The Williams & Wilkins 35 Book Co., Baltimore, 1967). 3-ketoglikozidok képződnek (M. J. Bemaerts, J. De Ley, 1963, Nature 197, 406). Anilinkék-mannitol-agar: növekedés színezék abszorpciója közben (A. A. Hendrickson, J. L. Baldwin, A. J. Riker, 40 1934, J. Bact. 28, 597—618). Lakmusztej: szürkésbarna. Karbohidrátok használata: oxidativ (R. Hugh, E. Leifson, 1953, J. Bact. 66, 24—26). A következő vegyületek szolgálnak egyedüli szénforrás- 45 ként a közegben R. Y. Stanier által leírt célokra (R. Y. Stanier és munkatársai, 1966, J. Gen. Microbiol. 43, 159 —271): D( + )glükóz, D( + )xilóz, D( + )treóz, D(+)trealóz, D(-)rinóz, L(+)ramóz, laktóz, cellobióz, maltóz, citrát, acetát, laktát, propionát, L-aszparaginsav, L-aszparagin, 50 L-hisztidin, L-alanin, L-arginin. összehasonlítva ezeket a tulajdonságokat a Bergey féle Manual of Determinative Bacteriology, VIII. kiadás kézikönyvben leírtakkal, láthatjuk, hogy a találmány szerinti mikroorganizmusok a Rhizobiaceae családhoz, az Agrobac- 55 terium fajhoz tartoznak. A 1302 számmal jelölt törzset 1978. április 6-án a Northern Regional Research Center of Peoria, 111., USA, helyen, ahol azt az NRRL B 11 291 jellel látták el, helyeztük el. A találmány értelmében az Agrobacterium genus mikro- 60 organizmusait levegőigényes körülmények között olyan tápközegben tenyésztjük, amely nitrogén-, szén- és foszforforrást, továbbá ásványi sókat tartalmaz. A tenyésztést 20 C* és 40 C°, előnyösen 25 C° és 35 C° között 10—48 óra, előnyösen 20—30 óra hosszat, 6,0—8,0 pH-n, előnyösen 7— 65 A D( - )-aminosavak közvetlenül termelődnek a fermentációs közegben, amely DL-hidantoinokat vagy DL-aminosav-N-karbamoil-származékokat tartalmaz egyedi nitrogénforrásként vagy a szokásos nitrogénforrásokkal együtt. D(—)-aminosavakat közvetlenül is termelhetünk mikrobiológiai iszapot használva maradék sejtekként vagy ezek kivonatát alkalmazzuk. A találmány szerinti enzimkomplexeknek a baktériumiszapból való extrakcióját az enzimológiában szokásosan használt módszerekkel végezzük. Erre a célra a sejteket megfelelő készülékekkel, például francia nyomósajtolóval, Manton Gauling homogenizátorral, forró dezintegrátorral és ultrahangos vibrátorral aprítjuk fel. A hidantoinok vagy az aminosavak N-karbamoil-származékainak a hidrolízisét úgy végezzük, hogy a reakcióelegyhez enzimet adunk a következő formában: friss cellák, fagyasztva szárított cellák, toluolozott cellák, acetonos por, továbbá nyers vagy porított kivonatok alakjában. További technikai és gazdasági javulást érhetünk el az enzimek löketésével, amelyet úgy érünk el, hogy az enzimeket makromolekulás vegyületekkel kombináljuk, kémiai kötéseket létesítünk a sejtközi állománnyal vagy ionos típusú kötéseket alakítunk ki vagy fizikailag rögzítjük azokat. A következő példák a találmány szerinti eljárást, illetve annak műveleti lépéseit részleteiben is bemutatják a találmány körének korlátozása nélkül. 1. példa A következő táptalajt készítjük el: húspepton 5 g húskivonat 3 g glükóz 5 g desztillált víz 1,000 ml A pH-t nátriumkarbonáttal 7,2-re állítjuk és a tápközeget 100—100 ml-es adagokra elosztva 500 ml-es lombikokba tesszük. 30 perces 110 C-on való sterilizálás után a lombikokat beoltjuk ferde tenyészetből származó N° 1302 törzs tenyészetével, amely ugyanazt a közeget tartalmazza 2% agarral (DIFCO) és 24 óra hosszat 30 C°-on orbitális keverés (220 ford/perc) közben inkubáljuk. Ebből a pre-kultúrából (D. O. 550 nm-nél: 0,250 szeres hígítás x 1 : 10) 5 ml-nyit 100 ml ugyanolyan közeggel ezt követően együtt inkubálunk 500 ml-es lombikokban és a tenyészetet 30 C°-on orbitális keverés (220 ford/perc) közben 24 óra hosszat inkubáljuk (D. O. 550 nm-nél 0,250 szeres hígítás 1 : 10). Ezután a sejteket összegyűjtjük, fiziológiás oldatban mossuk és végül 100 ml pirofoszfát-pufferben (0,1 mólos; 2
