181488. lajstromszámú szabadalom • Eljárás racém hidantoinok hidrlízisére optikailag aktív N-karbamoil -aminosav-származékokká és a hidrolizáló enzomkomplex előállítására
5 181485 6 2. példa Az 1. példában megadott eljárást Bacillus stearothermophilus NRRL 11 079 mikroorganizmussal megismételjük. A tenyésztést 40 C° hőmérsékleten végezzük. Az adagolást követő 4. órában 705 mg 5-(D,L)-fenil-hidantoinból 600 mg N-karbamoil-fenil-glicint kapunk, ami 85%-os hozamnak felel meg. 3. példa Az előzőekben megadott összetételű és literenként 1 g 5-(D,L)-metil-hidantoint tartalmazó táptalajt készítünk. A táptalaj pH-ját nátriumkarbonáttal 7,5-re állítjuk be, majd 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 50-50 ml térfogatú adagokat töltünk. 30 percen át 110 C° hőmérsékleten sterilezünk, majd hasonló összetételű és 2% Difco agart tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajon nőtt Bacillus brevis NRRL 11 080 törzzsel oltjuk a táptalajokat. A tenyésztést másodpercenként 220-at forduló, körkörös kitérésű rázógépen, 40 C° hőmérsékleten 22 órán át végezzük. Ebből az inokulumból (optikai sűrűsége 55 nm-en, 1:10 hígítás: 0,4) 2 ml-rel 500-ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml hasonló összetételű táptalajt oltunk, majd percenként 220-at forduló, körkörös kitérésű rázógépen, 40 C° hőmérsékleten 18 órán át tenyésztünk (spórázás előtti szakasz). 5000 g mellett 20 percen át centrifugálva elkülönítjük a sejteket a táptalajból, háromszor izotóniás, 8,0 pH-jú oldattal mossuk őket, majd 0,07 mólos pH 8,5 foszfát-pufferban szuszpendáljuk; ezek a nyugvó sejtek. Az enzimes hidrolízishez 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokban, 40 C° hőmérsékleten és percenként 220-at forduló, körkörös kitérésű rázóasztalon 64 ml, 200 mg baktériumot (száraz súly) és milliliterenként 20 pM (3,52 mg/ml) 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó reakcióelegyet rázunk. Megfelelő időközökben mérjük a hidrolízis termékét, azaz a D-karbamoil-fenil-glicint, a mérést 438 mji hullámhosszúságon kolorimetriásan végezzük. A mellékelt 1. ábrán megadjuk a keletkező karbamoilszármazék mennyiségét az elméleti kitermelés %-ában. Az abszcisszán az időt percekben, az ordinátán a keletkező D(—)-karbamoil-fenil-glicin mennyiségét adjuk meg %-ban. 4. példa A 3. példában megadottak szerint Bacillus brevis NRRL 11 080 sejteket állítunk elő. 0,1 mólos 8,5 pH-jú foszfátpufferban milliliterenként 41,5 mg száraz súlynak megfelelő baktériumsejtet szuszpendálunk, majd Manton Caulin homogenizátorral, 35 C° hőmérsékleten, 600 kg/cm2 nyomáson feltárjuk őket. 30 percen át 25 000 g nehézségi gyorsulás mellett centrifugálva eltávolítjuk a sejtlörmeléket. A 280 egység enzimet tartalmazó 30 ml térfogatú felülúszóhoz 970 ml 0,2 mólos, 8,5 pH-jú, 4,7 g 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó foszfát-puffért adunk. Egy egység az az enzimmennyiség, amely 20 pM/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó 0,2 mólos, 8,5 pH-jú foszfát-pufferban 50 C° hőmérsékleten egy perc alatt egy pM/ml szubsztrátumot alakít át. Egy óra múlva a reakcióelegyben 3,2 g D-karbamoil-származék van, amely megfelel 63%-os hidrolízisnek. 5. példa Az alábbi összetételű félszintetikus táptalajt állítjuk elő: NH4C1 0,5% Na3P04 0,705% KH2P04 0,272% húspepton 0,5% élesztőkivonat 0,05% 5-(D,L)-metil-hidantoin 0,1% A táptalajt 50—50, illetve 100—lOOml-enként 250 ml, illetve 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokba osztjuk szét, és 30 percen át 110C° hőmérsékleten sterilezzük. Az inokulum előállítására Bacillus brevis NRRL 11 080 ferdeagar-tenyészetről oltjuk a 250 ml-es lombikokat, majd a 4. példában megadottak szerint 22 órán át 40 C° hőmérsékleten tenyésztünk. A tenyészet 2,5 ml-ével (optikai sűrűség 550 nm-en mérve 0,105; hígítás 1 : 10) oltjuk az 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban sterilezett hasonló összetételű táptalajt. 15 órán át 40 C° hőmérsékleten, a fentiek szerint tenyésztünk, majd a 4. példában megadott módon összegyűjtjük a nyugvó sejteket. Az enzimes hidrolízist 40 C° hőmérsékleten olyan reakcióelegyben végezzük, amely 64 ml pufferban 100 mg baktériumot (száraz súly, amely megfelel 100 ml tenyészetben lévő sejtmennyiségnek) és 20 pM/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmaz. A reakció 5., 10. és 15. percében meghatározzuk a keletkező karbamoil-származék mennyiségét. Az adatokat a 2. táblázatban adjuk meg. 2. táblázat idő (perc) 5 10 15 A keletkező karbamoil-származék mennyisége (pM/ml) 0,6 1,0 1,4 6. példa Friss vízzel nem kezelt kukoricalekvárból 2,6%-os (száraz súlyra számítva) táptalajt készítünk. A táptalaj pH-ját KOH-dal 7,5-re állítjuk be, majd 50—50 ml-enként 250 ml térfogatú, illetve 100—100 ml-enként 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokba osztjuk szét. A sterilezést 110 C° hőmérsékleten, 30 percen át végezzük. Az 50 ml térfogatú táptalajokat inokulum előállítására Bacillus brevis NRRL 11 080 ferdeagar tenyészetről oltjuk, majd a 4. példában megadott módon 40 C° hőmérsékleten 22 órán át tenyésztünk. Az inokulum 2,5—2,5 ml-ével beoltjuk az 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban sterilezett táptalajokat. 18 órán át 40 C° hőmérsékleten inkubálunk a fentiek szerint, majd a nyugvó sejteket a 3. példában megadottak szerint elkülönítjük. Az enzimes hidrolízist 40 C° hőmérsékleten az alábbi reakcióelegyekben végezzük: 1. 64 ml foszfát-pufferban (0,07 mólos, pH 8,5), amely 100 ml tenyészetből nyert sejteket és 20 pM/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmaz; és 2. 64 ml foszfát-pufferban (0,07 mólos, pH 8,5), amely 100 ml tenyészetből nyert sejteket és 20 pM/ml 5-(D,L)-para-metoxi-fenil-hidantoint tartalmaz. A keletkező karbamoil-származék mennyiségét a reakció 5., 10., 15. és 60. percében meghatározzuk. Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
