181488. lajstromszámú szabadalom • Eljárás racém hidantoinok hidrlízisére optikailag aktív N-karbamoil -aminosav-származékokká és a hidrolizáló enzomkomplex előállítására
7 181488 8 3. táblázat Idő (perc) A keletkező N-karbamoil-fenilglicin A keletkező N-karbamoil-parametoxi-fenild-glicin pM/ml Konverzió, % pM/ml Konverzió, % 5 6,55 32,8 6,45 32,3 10 11,1 55,5 10,9 54,5 15 15,05 75,5 14,85 74,2 60 19,8 99,0 19,85 99,2 7. példa A Bacillus brevis NRRL 11 080 törzs sejtjeiből acetonos port állítunk elő. 0,350; hígítás 1 : 10) szobahőmérsékleten, Alfa-Laval centrifugával elkülönítjük a sejteket a táptalajtól. A sejteket 8,0 pH-jú izotóniás sóoldattal mossuk, majd enzimaktivitásuk szerint adagoljuk őket. Az enzimes hidrolízist 40 C° hőmérsékleten végezzük, az alábbi reakcióelegyekben: 1.64 ml 0,07 mólos, 8,5 pH-jú foszfát-puffer, 0,5 g sejtpaszta (0,120 g száraz sejttel azonos mennyiség) és 20 jiM/niI 6-(D,L)-hidantoin; 2. mint az 1. reakcióclegy, azzal a különbséggel, hogy 20 pM/ml 5-(D,L)-para-metoxi-fenil-hidantoint tartalmaz. 4 A keletkező karbamoil-származék mennyiségét a reakció 5., 10., 15. és 60. percében meghatározzuk. Az adatokat a 4. táblázatban adjuk meg. 10 15 80 mg ilyen port, amely 420 egység enzimet tartalmaz, 1 liter 0,2 mólos, 8,5 pH-jú, 5,0 g 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó foszfát-pufferban szuszpendálunk. Egy óra múlva, 50 C° hőmérsékleten 4,8 g D-karbamoilszármazékot kapunk, amely 87%-os kitermelésnek felel meg. 8. példa 20 literes, 16 liter táptalajt tartalmazó Fomel fermentorban Bacillus brevis tenyészetet állítunk elő. A táptalaj a következő összetételű: élesztőkivonat 1,0% húspepton 1,0% NaCl • 0,3% K2HP04 0,056% 5-(D,L)-metil-hidantoin 0,1% A táptalaj pH-ját 7,8-re állítjuk be. A sterilezést 30 percen át 110 C° hőmérsékleten végezzük. Inokulumot készítünk oly módon, hogy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100 ml térfogatú, a fentivel azonos összetételű táptalajt oltunk, majd 16 órán át, 40 C° hőmérsékleten percenként 220-at forduló körkörös rázógépen tenyésztünk. A tenyésztés befejezésekor az optikai sűrűség 1 : 10 arányú hígítás után, a mérést 550 nm hullámhoszszon végezve: 0,360. 160 ml így előállított oltóanyaggal beoltjuk a fermentorban lévő táptalajt. A fermentációt 41 C° hőmérsékleten végezzük, a fermentáció közben 2N sósav automatikus adagolásával 7,8-en tartjuk a táptalaj pH-ját. A fermentáció 16. órájában (optikai sűrűség 550 nm-es hullámhosszon mérve: 4. táblázat Idő (perc) A keletkező N-karbamoil-fenil-glicin A keletkező N-karbamoil-para-metoxi-fenilglicin |iM/ml Konverzió, % pM/ml Konverzió, % 5 4,05 20,2 4,10 20,5 10 7,6 38,0 7,65 38,2 15 10,4 52,0 10,5 52,5 60 18,2 91,0 18,1 90,5 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás racém hidantoinok optikailag aktív N-karbamoil-aminosavakká való átalakulását katalizáló enzimkomplex előállítására, azzal jellemezve, hogy a Bacillus genusba tartozó, hidropirimidin-hidrolázt termelő termofil mikroorganizmus-törzset, előnyösen Bacillus stearothermophilus (NRRL B—11 079) és Bacillus brevis (NRRL B 11 080) mikroorganizmust asszimilálható szén- és nitrogénforrást, ásványi sókat, valamint induktorként valamely hidantoin-származékot tartalmazó tápközegben süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztünk, és kívánt esetben a kapott enzimkomplexet ismert módon kinyerjük. 2. Eljárás racém hidantoinok hidrolízisére optikailag aktív N-karbamoil-aminosav-származékokká enzim-komplex segítségével, azzal jellemezve, hogy a reakciót az 1. igénypont szerinti eljárással kapott, a Bacillus genusbe tartozó, hidropirimidin-hidroláz aktivitással rendelkező termofil mikroorganizmusból származó enzimkomplex segítségével végezzük. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás hidantoinok hidrolízisére, azzal jellemezve, hogy a reakciót 30 C° és 60 C° közötti hőmérsékleten végezzük. 20 25 30 35 40 45 50 2 db ábraoldal A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 84,5401.66-4. Alföldi Nyomda, Debrecen Felelős vezető: Benkő István igazgató
