181488. lajstromszámú szabadalom • Eljárás racém hidantoinok hidrlízisére optikailag aktív N-karbamoil -aminosav-származékokká és a hidrolizáló enzomkomplex előállítására
3 181488 4 kát, kazeint vagy szójababot használunk. Az enzim-aktivitást D,L-hidantoinokkal, előnyösen D,L-5-metil-hidantoinnal indukáljuk. Az indukálószert adhatjuk közvetlenül a táptalajhoz, sterilezés előtt, vagy a mikroorganizmusok tenyésztése közben. A Bergey’s Manual 7. kiadása szerint meghatározott alaktani és élettani tulajdonságok szerint a találmány szerinti eljárás során használt törzsek a Bacíllaceae család Bacillus neméhez tartoznak, faj szerint Bacillus brevis és Bacillus stearothermorphilus. A találmány szerinti eljárás jelentős, a találmány oltalmi körébe tartozó része az a más forrásokból származó hidrolázokra nem jellemző tény, hogy a fenti törzzsel termelt enzim a D,L-5-fenil-hidantoinnal azonos sebességgel hidrolizálja a D,L-5-para-metoxi-fenil-hidantoint. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a mikroorganizmusok tenyésztésével előállítjuk a specifikus enzimet, az előállított enzimmel, amit használhatunk baktérium szuszpenzióként, baktérium tenyészetként, vagy elkülöníthetjük a sejtekből, a hidantoinokat D-aminosav-származékokká hidrolizáljuk. A hidantoin-származékok szelektív hidrolízisét mikroorganizmusokkal D,L-aminosavakká az alábbiak szerint végezzük és mérjük. A különböző földmintából, trágyából, növényekből vagy hulladékból izolált baktériumtörzseket 50 C° hőmérsékleten 250 ml térfogatú, 50 ml alábbi összetételű táptalajt tartalmazó Erlenmeyer-lombikban tenyésztjük: húspepton 1% élesztőkivonat 1% NaCl 0,3% D,L-5-metil-hidantion 0,1% A táptalaj pH-ját 7,2-re állítjuk be, a sterilizálást 30 percen át 110 C° hőmérsékleten végezzük. 18—20 órán át 50 C° hőmérsékleten, körkörös kitérésű rázógépen végezzük a tenyésztést. Ezután 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett 100 ml táptalajt oltunk 2—2 ml ily módon készített inokulummal. 16—18 órán át tenyésztünk, majd az alábbiak szerint elvégezzük az enzimreakciót a sejtekkel: kémcsövekbe 10 ml pH 8,5 0,07 mólos foszfát-puffért és 20pM/ml D,L-5-fenil-hidantoint, továbbá 1 ml, száraz súlyra számítva 40 mg/ml-es baktérium szuszpenziót töltünk. 15 percen át 40 C° hőmérsékleten inkubáljuk a sejtszuszpenziót, majd a keletkezett karbamoil-származék mennyiségi meghatározására p-dimetil-amino-benzolaldehidet adunk hozzá. A mérést J. Biol. Chem., 238, 3325, 1963. szerint végezzük. Az 1. táblázatban ismertetjük a használt törzseket. Ezeket 1977. február 11-én letétbe helyeztük a Northern Regional Research Center (Peoria, 111., USA) törzsgyűjteményében, ahol az 1286 és 1287 sorszámú törzsek az NRRL B—11 079 és NRRL B—11 080 jeleket kapták, sorrendben. 1. táblázat Törzs N-karbamoil-fenil-glicin az elméleti ho-zam %-ban 1287 60% 1286 10% Megfigyeltük, hogy míg a D-hidantoin enzimatikus hidrolízise alkalikus pH-értéken (pH 7—10) folyik, a visszamaradó L-hidantoin egyidejűleg nem enzimatikusan racemalizálódik. Ezért és mert az enzimatikusan hidrolizálódó D-hidantoin folyamatosan fogy a reakcióelegyben, a reakció végterméke a D-alak karbamoil-származéka. Az L-hídantoin racemizálódásának sebessége a hőmérséklet és a pH függvénye, és minél magasabb a hőmérséklet és a pH-érték, annál gyorsabb. Ugyanekkor, ha 8 körüli értékre állítjuk be a reakcióelegy pH-ját, ez a sebesség nem olyan gyors, hogy befolyásolná a hidantoináz okozta hidrolízis sebességét. Az enzimreakciót 10 C° és 60 C°, gyakorlati szempontból előnyösen 35 C° és 55 C° közötti hőmérsékleten végezzük. Az N-karbamoil-fenil-glicint és az N-karbamoil-(para-metoxi)-fenil-glicin kémiai azonosítását a reakciótermék újrakristályosítása után az infravörös abszorpciós és a mágneses magrezonancia spektrum felvételével, tömegspektroszkópiával és elemanalizissel végezzük. 25 C® A vegyületek optikai forgatása sorrendben: [ct]D : —137° (konc.: 1, IN NH40H) és [a]”C : —140° (konc.: 1, IN NH4OH), ami megfelel az irodalomban megadott értékeknek. A találmány szerinti enzimes hidantoin-hidrolízis nem csak a növekedési fázisban lévő mikroorganizmusok, a sértetlen sejtek vagy spóráik jelenlétében következik be, de végbemegy a fenti mikroorganizmusok kivonatainak adagolása után is. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy a sejtekben lévő hidroláz felhalmozására folyékony halmazállapotú táptalajban tenyésztjük a mikroorganizmusokat, majd megfelelő időben hozzáadjuk a tenyészethez a D,L-hidantoin-származékokat. Végezhetjük az enzimes hidrolízist úgynevezett „nyugalmi” állapotban levő sejtekkel is. Ebben az esetben elkülönítjük a baktériumsejteket a táptalajból, majd alapos mosás után megfelelő, pufferezett oldatban szuszpendáljuk őket, és a szuszpenzióhoz hozzá adjuk a racém hidantoint. Eljárhatunk úgy is, hogy hidrolázt tartalmazó készítményeket állítunk elő. Ebben az esetben a fentiekben ismertetett mikroorganizmusok sejtjeiből kivonatokat készítünk, vagy előállítjuk a kivonatok koncentrátumait, vagy például a nyers vagy tisztított hidrolázokat tartalmazó készítményeket. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint technikai és gazdaságossági továbbfejlesztésként immobilizáljuk az enzimet. Ebben az esetben az enzimet és valamely makromolekuláris vegyüíetet kombinálunk kémiai, ionos vagy fizikai kötésekkel. A következő példákban a találmány szerinti eljárást részletes példákkal szemléltetjük, az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 100 ml térfogatú, fentiekben ismertetett összetételű táptalajt sterilezünk, majd Bacillus brevis NRRL B 11 080 mikroorganizmussal oltjuk be. Körkörös kitérésű rázógépen 40 C° hőmérsékleten tenyésztünk, majd a tenyésztés 18. órájában 100 ml 0,14 mólos, pH 8,5, milliliterenként 40 pM 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmazó foszfát-puffért adunk hozzá. További négy órán át hasonló körülmények között folytatjuk a tenyésztést, majd meghatározzuk a keletkezett N-karbamoil-fenil-glicint. 705 mg 5-(D,L)-fenil-hidantoinból 700 mg N-karbamoil-fenil-glicin keletkezik, ami 90%-os hozamnak felel meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
